生物型人工肝用肝非实质细胞研究进展

生物型人工肝用肝非实质细胞研究进展　张行芬．黄建荣　（浙江大学医学院附属第一医院传染科，杭州３１０００３）　

Ｄｒａｇ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，２００７　Ｖｏ１．４　Ｎｏ．１　

【中图分类号】Ｒ５７５．３，Ｒ３１８，Ｒ９　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７２—２８０９（２００７）０１—００５２—０３　人工肝支持系统是治疗肝衰竭的有效手段．其　作为肝移植围手术期治疗的适应证也得到了公认　近年在人工肝研究方面虽取得了较大进展．但尚无　一种人工肝能完全替代肝脏的全部功能　现有的动　物实验及早期临床应用清楚地表明．生物型人工肝　不仅能为肝衰竭患者提供强大的解毒、生物合成功　能以及稳定内环境、阻断恶性循环，而且为肝细胞再　生提供了条件和时间ｌ】．２．３】　生物型人工肝由生物反应器、半透膜、血液循环　系统和生物材料等组成　其核心是生物反应器中的　生物成分．肝细胞是生物型人工肝的核心原材料，目　前应用于人工肝的肝细胞培养已取得了很大的进　展．但远未达到理想效果．理想的肝细胞培养要求最　大可能的接近体内环境ｌ４１５１．同样生物反应器内的肝　细胞发挥其功能也必须最大可能的模拟机体内环　境．因此离不开肝非实质细胞及肝间质的支持与调　节　近年来兴起的采用肝实质细胞和间质细胞共同　培养方法．能获得肝小叶相似的功能，应用于生物型　人工肝研究已取得一定的进展旧　１肝非实质细胞　肝脏可分为实质和非实质细胞．肝非实质细胞　包括肝窦内皮细胞、库普弗细胞、肝星形细胞及胆管　上皮细胞、肝脏特异性自然杀伤（Ｐｉｔ）细胞（来源于血　液．能在肝内增殖１等。它们各自有其特异生物学功　能　其中　肝窦内皮细胞占肝非实质细胞的比重最　大．约４４　６０％．沿肝窦连续性链状分布，通过细胞　问的间隙与Ｄｉｓｓｅ间隙相通　其在调节肝实质细胞　与肝窦血液之间的物质转运、肝脏微循环、凝血和血　管收缩方面起着重要作用，并具有吞噬、清除、合成　细胞外基质（ＥＣＭ）和参与脂质代谢的重要功能。库　普弗细胞数量是仅次于肝窦内皮细胞的另一类肝非　实质细胞．约占３０％，定居在肝窦内的巨噬细胞，占　．综　述．　全身单核巨噬细胞总数的８０％～９０％　库普弗细胞对　于维护机体的正常功能具有重要意义．活化的库普　弗细胞参与肝纤维化的形成　肝星形细胞位于Ｄｉｓｓｅ　间隙内．星形细胞数量虽不多．但它与内皮细胞及肝　实质细胞接触面广．围绕在肝窦的周围．可合成　ＥＣＭ、摄取并　存维生素Ａ。Ｐｉｔ细胞位于肝实质细　胞的血窦面．与血液直接接触．而且还与肝实质细胞　和库普弗细胞接触．其伪足可穿过肝实质细胞到达　Ｄｉｓｓｅ间隙．与肝细胞微绒毛接触。　２肝非实质细胞与肝细胞共同培养　２．１肝细胞与肝窦内皮细胞共同培养：Ｒｏｂｅｒｔ等ｌ　８】　采用强化培养液．将大鼠表皮细胞与正常人工肝细　胞进行共同培养，建立了人肝细胞株ＨＨ２５、ＨＨ０１、　ＨＨ０９．表明肝窦内皮细胞在肝细胞的培养和功能维　持方面确有重要的作用．其原因可能与肝窦内皮细　胞分泌ＥＣＭ、肝细胞生长因子（ＨＧＦ）等有密切的关　系　Ｇｏｕｌｅｔ将分离的正常鼠肝细与肝内皮细胞共同　培养．肝细胞可以保持形态学上的完整大约４ｗ。它　们重新呈岛状排列．所有肝细胞能保持其缝隙接合　的管道．并持续高水平的分泌白蛋白。　２．２活化的库普弗细胞在肝纤维化中起重要作用　．　它可释放促炎性细胞因子如白细胞介素（ＩＬ）－６和肿　瘤坏死因子ｏｔ（ＴＮＦ－ｏｔ）等．参与并促进炎症反应㈣。　肝库普弗细胞的吞噬和清除功能．可弥补生物型人　工肝在这方面的缺陷．使生物型人工肝的功能更完　善．在清除肝衰竭患者体内毒素中发挥更好的作用。　库普弗细胞还能合成分泌ＨＧＦ．如缺少库普弗细　胞．生物型人工肝系统在提供肝再生物质、促进肝细　胞再生修复方面的作用将减弱。　２－３其他的一些肝非实质细胞与肝细胞共同培养：　Ｂｈａｎｄａｒｉ等ｌｌｌ】将鼠原代肝细胞与３Ｔ３成纤维细胞共　同培养。在分离１８ｄ后，与纯培养组对照，共同培养　

作者简介：张行芬（１９８３一），女，硕士研究生，住院医师，研究方向：重型肝炎与人工肝治疗的研究。　通讯作者：黄建荣，教授，主任医师，Ｅｍａｉｌ：ｈｚｈｕａｎｇｃｈｉｎａ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ．ｃｎ　

维普资讯 http://www.cqvip.com 药品评价２００７年第４卷第１期　系统中肝细胞保持着较好活性．有良好的管道系统　和很强的分泌白蛋白的能力　鼠干细胞培养液中的　人类干细胞可在去分化的状态下无限增殖．目前无　需鼠干细胞培养液．胚胎干细胞在加入细胞外基质　和纤维母细胞的培养环境中也能无限的增殖［１２】　Ｒｏｊｋｉｎｄ等『ｌ３】将星状细胞和新分离的肝细胞共同培　养时．发现异种类型细胞之间也形成了缝隙连接，且　使肝细胞功能保持至少２ｗ。由此可见，细胞之间相　互作用对于保持细胞表型有很大影响。Ｐｉｔ细胞对肝　细胞的作用机制不清．肝细胞对正常大鼠Ｐｊｔ细胞　的溶解作用十分敏感．在肝细胞的再生及增殖中可　能发挥重要的作用。目前由于Ｐｉｔ细胞体外存活时　间短，培养困难，使其应用研究受到很大限制㈣，如　能在Ｐｉｔ细胞研究方面有突破．将有助生物人工肝　细胞材料的应用　３非实质细胞的永生化研究　永生化原代人肝细胞应用于生物人工肝的动物　实验已初见良好效果［１５・１６１。随着细胞培养、基因转移　切割等生物技术的发展．肝非实质细胞的永生化也　会成为生物人工肝研究的一部分。Ｍａｔｓｕｍｕｒａ和　Ｗａｔａｎａｂｅ等［１７・・８】成功地构建了人可恢复性肝窦内皮　细胞株（ＴＭＮＫ—ｌ１和可恢复性肝星状细胞株（ＴＷＮＴ—　ｌ１。研究中发现ＴＭＮＫ—ｌ可表达凝血因子ＶＩＩＩ、血管　内皮生长因子受体，ＣＤ　，可乙酰化低密度脂蛋白，经　脂多糖处理后可产生ＴＮＦ一仅、ＩＬ一６、细胞间粘附分　子一ｌ、血管粘附分子及ＶＥ一钙粘蛋白等。ＴＷＮＴ—ｌ　可分泌肝细胞生长因子、Ｉ型胶原，摄取乙酰化的低　密度脂蛋白：ＴＷＮＴ—ｌ与ＮＫＮＴ一３共同培养可增加　白蛋白的合成、提高尿素合成能力及ＣＹＰ３Ａ４和　ＣＹＰＣ２９活性。肝窦内皮细胞参与肝内微循环建立。　其在调节肝实质细胞与肝窦血液之间物质转运、肝　脏微循环、凝血和血管收缩方面起重要作用，并具有　吞噬、清除、合成ＥＣＭ和参与脂质代谢的重要功能。　星状细胞能合成ＥＣＭ、摄取并贮存维生素Ａ，对肝　实质细胞损伤后的再生与修复有重要作用。肝脏发　挥其正常功能严格依赖于肝组织学结构、肝血液微　循环、肝组织与肝非实质细胞间的相互作用，共同培　养系统为深入研究细胞间相互作用提供了一个平　台，为发展更接近生理水平的细胞治疗提供了条件。　４共同培养系统中肝非实质细胞生物学作用及作　用机理　４．１　肝非实质细胞与肝细胞共同培养。能更好地模　拟体内环境．有助于肝细胞保持其结构稳定性及生　物学功能发挥，促进生物人工肝疗效进一步完善『ｌ９】。　Ｂｈａｔｉａ等［２Ｏｌ发现在肝细胞与非实质细胞共同培养时　可观测到功能性接触．表明共同培养有助于保持肝　细胞间特有的胆管结构，促进形成缝隙连接。并且实　验还表明了共同培养可使肝细胞表达许多肝脏特异　性生物效应物质，如白蛋白、谷胱甘肽Ｓ一转移酶　ｆＧＳ１ｒ）等，与单纯培养组肝细胞对照，ＧＳＴ在共同培　养时更为稳定．有一些亚单位可稳定表达超过１２ｄ。　ｓ】ａｕｓ等［２１１实验表明，肝细胞单纯培养与共同培养系　统都能使羟基类固醇磺基转移酶的活性保持在一个　较高的水平．但是共同培养系统中羟基类固醇磺基　转移酶的活性更高．几乎可达到刚分离时的肝细胞　水平。　ＣＹＰ２Ｂ是细胞色素Ｐ一４５０的一个亚群，在肝细　胞体外培养过程中．细胞色素Ｐ一４５０消失很快，其　中消失最快的属ＣＹＰ２Ｂ亚群　Ａｋｒａｗｉ等在实验中　发现．在肝细胞纯培养４ｄ后．几乎检测不到肝细胞　的ＣＹＰ２Ｂ的ｍＲＮＡ．但可用苯巴比妥诱导出来；而　在共同培养系统中．在４至１４ｄ期间ＣＹＰ２Ｂ的　ｍＲＮＡ可保持在一个相对稳定浓度．若培养７ｄ后用　苯巴比妥诱导．可检测到ＣＹＰ２Ｂ的ｍＲＮＡ，其浓度　增加ｌ２　ｌ５倍　用ｍＲＮＡ酶保护分析法测定在共同　培养系统中ＣＹＰ２Ｂｌ和ＣＹＰ２Ｂ２浓度和分析其可诱　导性．发现其与在体内时相同。Ｃａｎａｐｌｅ等【　９１从正常　的肝细胞组织中用生物学方法去除掉肝非实质细　胞．发现由ＴＮＦ一　诱导的ＤＮＡ合成减少，肝细胞更　易发生凋亡．而在另一组纯培养的肝细胞中加入非　实质细胞．发现肝细胞发生细胞凋亡较前明显减少。　肝细胞表面存在过氧化物酶体增生物（ＰＰＳ）受体　ＰＰＳ一仅．而ＰＰＳ可诱导肝的过氧化物酶体增生及　ＤＮＡ合成．肝非实质细胞还能促进肝细胞对ＰＰＳ的　反应　ＰＰＳ和ＰＰＳ受体结合后可以抑制肝细胞的凋　亡．因而肝非实质细胞有抑制肝细胞凋亡的作用。推　测当肝细胞与肝非实质细胞共同培养应用于生物人　工肝时．可通过抑制肝细胞的凋亡来延长肝细胞的　生存时间，使生物人工肝的作用得到充分发挥。有学　者致力于研究肝间充质干细胞的分离与培养方法．　Ｂｒｉｌｌ等用含二甲亚砜激素限定培养液建立了鼠原　代胎肝细胞长期培养方法发现了两类肝祖细胞。　４．２从前文中可以知道肝非实质细胞能提高生物　人工肝肝细胞的活性及功能．但其作用机理尚未明　

维普资讯 http://www.cqvip.com ——５４——　确，推测与共同培养系统更接近体内肝细胞生长的　内环境有关，肝非实质细胞可产生ＥＣＭ［Ｓ１．其可能在　稳定肝细胞表型方面起到一定作用。肝非实质细胞　与肝细胞共同培养可通过抑制肝细胞凋亡来延长肝　细胞的存活时间㈣。另外，共同培养系统中肝实质细　胞与肝细胞间直接接触．并可观测到细胞间的缝隙　连接『ｌ３，２ｏ］，有助于细胞间的信息传递．这些都可能是　肝非实质细胞发挥其生物学效应的作用机理　、　随着细胞分离、培养技术和基因转化技术的提　高．生物材料的不断改进．生物型人工肝已１３趋完　善。但如何保持生物反应器中的肝细胞活性和功能．　通过应用新的生物材料、生长因子、与肝非实质细胞　共培养及组织工程等，诱导肝细胞保持其膜的极性．　使肝细胞在体外聚集成球形或细胞族的三维立体结　构，增强肝细胞的活性和分化功能。非实质细胞因其　特殊的生物学效应．其与肝细胞共同培养将为成为　生物人工肝研究的重要部分．值得进一步的深入研　究。　５参考文献　【１】Ｍｕｌｌｉｎ　ＥＪ，Ｍｅｔｃａｌｆｅ　ＭＳ，Ｍａｄｄｅｒｎ　ＧＪ．Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｓｕｐｐｏｒｔ：　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｔｏ　ｒｅｔａｒｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊｌ？Ａｒｃｈ　Ｓｕｒｇ，２００４，１３９：　６７０—６７７．　［２１２　Ｗａｔａｎａｂｅ　ＦＤ，Ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎ　ＣＲ，Ｃｏｈｅｎ　ＳＭ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｃｅｔａｍ　ｉｎｏｐｈｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｆｕｌｍｉｎａｎｔ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆａｉｌｕｒｅ　ｗｉｔｈ　ａ　ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｌｉｖｅｒ［Ｊ】．Ｔｒａｎｓ．ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｃ，１９９７，２９：４８７－４８８．　［３１３　Ｓａｍｕｅｌ　Ｄ，Ｉｃｈａｉ　Ｐ，Ｆｅｒａｙ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｄｕｒｉｎｇ　ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｓｅｓｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｃｕｔｅ　ｌｉｖｅｒ　ｆａｉｌｕｒｅ　ａｗａｉｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ［．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００２，７３：　２５７—２６４．　【４】Ｐａｚｚｉ　Ｐ，Ｓｃａｇｌｉａｒｉｎｉ　Ｒ．Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｓｙｓｔｅｍｓ：ｓｔａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｒｔ［Ｊ［．Ａｎｎ　ｈａｌ　Ｃｈｉｔ，２０００，７１：３１９－３２３．　【５】Ｔｓｉａｏｕｓｓｉｓ　Ｊ，Ｎｅｗｓｏｍｅ　ＰＮ，Ｎｅｌｓｏｎ　ＬＪ，ｅｔ　ａ１．Ｗｈｉｃｈ　ｈｅｐａｔｏ—　ｃｙｔｅ　ｗｉｌｌ　ｉｔ　ｂｅ？Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｃｈｏｉｃｅ　ｆｏｒ　ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｓｕｐ－　ｐｏｒｔ　ｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ［．Ｌｉｖｅｒ　Ｔｒａｎｓｐｌ。２００１．７：２－１０．　【６１　Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｍ，Ｉｓｈｉｄａ　Ｙ，Ｋｅｏｇｈ　Ａ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｃｏ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ（ＨＳＣ）ｌｉｎｅ　ＬＩ９０［Ｊ】．Ｉｎｔ　Ｊ　Ａｒｔｉｆ　Ｏｒｇａｎｓ，　１９９８，２１：３５３－３５９．　【７】王英杰，李梦东，王字明，等．生物ＡＩｆｆＦ［Ｍ】；北京：人民卫　生出版社．２００２．１３９—１４６．　［８１８　Ｒｏｂｅｒｔ　ＥＡ，Ｌｅｔａｒｔｅ　Ｍ，Ｓｑｕｉｒｅ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕ－　ｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｌｉｎｅｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ［．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９４，１９：１９３０－１３９９．　【９】Ｗｉｎｗｏｏｄ　ＰＪ，Ａｒｔｈｕｒ　ＭＪＰ．Ｋｕｐｆｆｅｒ　ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅｉｒ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ