海洋硫酸多糖911的荧光标记研究

海洋硫酸多糖911的荧光标记研究李福川,耿美玉,李英霞,李　静,苗本春,管华诗(青岛海洋大学海洋药物与食品研究所,青岛266003)

摘要　硫酸多糖(911)还原性末端的半缩醛基,通过还原胺化反应与酪胺(Tyr)的氨基共价偶联,9112Tyr

中酪胺引入的仲氨基通过与异硫氰酸酯荧光素(FITC)进行亲核反应,实现对911还原末端的选择性荧光标

记.用UV2Vis吸收光谱、1HNMR和HPSEC对偶联与标记结果进行确证,从1HNMR谱推测911与酪胺

的偶联率及FITC对9112Tyr标记率分别为60%和80%.由于采用的是911末端选择性标记,对911的抗凝活性无明显影响,也无明显的细胞毒性.以荧光标记的911作为探针,对淋巴细胞有较强的选择性标记染色.该法适用于具有还原末端的多糖及寡糖的荧光标记.

关键词　硫酸多糖;还原胺化;荧光标记中图分类号　Q26 文献标识码　A 文章编号　025120790(2002)0921704205

收稿日期:2001207227.

基金项目:国家自然科学基金(批准号:30070694)资助.

联系人简介:耿美玉(1963年出生),女,博士,教授,博士生导师,从事海洋药物研究.

蛋白与核酸荧光探针作为一种强有力的研究工具,已广泛应用于组织学、细胞生物学、免疫学、药理学、临床医学等各个领域.近30年来,随着分子生物学及现代分析技术的飞速发展,作为生命三大物质之一的多糖倍受人们的关注.多糖具有许多生物学功能,尤其在以生物大分子相互作用为基础的细胞识别和信号传导过程中发挥着重要的作用.但由于多糖组成与结构的复杂性,致使多糖结构生物学研究受到极大的限制;同时由于缺乏微量定量检测技术,使以多糖为基础的药物药代动力学研究成为多糖药物开发的瓶颈因素.

有关多糖荧光标记的研究目前国内外报道较少,已有的标记方法大多缺乏选择性,从而影响和破坏了多糖的内部结构,不能很好地反映多糖的生物学活性,且研究领域多集中在多糖药代动力学的微量检测探讨上[1,2].Malsch等[3]用亚硝酸降解肝素,对低分子肝素进行选择性末端标记,较好地避免了非选择性标记对肝素内部活性结构的影响.但该方法需要一个自由的末端醛基,因此不适用于一般多糖和寡糖.

我们利用多数多糖及寡糖具有还原性末端的特点,通过对其半缩醛基的还原氨化引入易与异硫氰酸酯荧光素(FITC)反应的仲氨基,达到对具有还原性末端的一般多糖及寡糖进行选择性末端荧光标

记的目的.硫酸多糖911是从褐藻中提取出来的,经进一步分级纯化及化学修饰而得到的一种由甘露糖醛酸和古罗糖醛酸聚合而成的聚阴离子直链硫酸多糖,平均分子量为8000.研究发现,911具有抗病毒、抗凝血和免疫增强等活性[4],已被国家医药管理局作为抗爱滋病药物批准进入临床研究.本文

以911为对象,对其还原性末端进行了选择性荧光标记研究,并对标记物进行了结构确证,同时以911

的抗凝活性为指标,研究了该标记方法对911生物活性的影响,并以标记911为探针对活细胞染色情况进行了初步探讨.

1　实验部分1.1　试剂与仪器硫酸多糖(911)(本所提供);氰基硼氢化钠、酪胺和异硫氰酸荧光素(FITC)(美国Sigma公司提

供);Sephadex

TM

G225(瑞典Pharmacia公司提供);RPMI1640培养基(美国GIBCOBRL公司提供);其

它试剂均为分析纯.

Vol.23高等学校化学学报 No.9　

2002年9月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 1704～1708

DU640型蛋白核酸紫外分析仪(美国贝克曼公司);2410型高效液相色谱仪(德国Waters公司);

JEOLJNM2ECP600型核磁共振仪(日本电子株式会社);EZ550Q型冻干机(美国FTS公司);

PABER󰂪型血小板聚集及血凝测试仪(北京世帝科学仪器公司);BB5060型CO2

培养箱[中德合资

Heraeus公司(上海)];RAIBOW型酶标仪(奥地利);B.D.Vantage型流式细胞仪(美国B.D.公司).

1.2　911-Tyr

的合成

将400mg911溶于15mL0.2mol󰃗L的磷酸钾缓冲液(pH8.0),然后依次加入400mg酪胺和

150mg氰基硼氢化钠,于37℃下反应96h,间或振荡.反应完毕,离心分离,将其上清液上SephadexTMG225柱,用水洗脱,280nm检测,收集第一峰,冻干得9112Tyr.1.3　911-Tyr-FITC

合成

取200mg9112Tyr溶于水,用0.5mol󰃗LNaHCO3调pH至8.5,然后加入25mgFITC,于室温、避光下反应过夜,向反应物中加入无水乙醇至乙醇终浓度为80%,有大量亮黄绿色沉淀析出,离心弃去上清液.沉淀加水复溶,乙醇再沉淀,反复3次,条件同上,得9112Try2FITC,并进一步上SephadexTMG225柱纯化,收集相应水洗脱组分冻干保存.

1.4　高效尺寸排阻色谱(HPSEC)

各样品按5mg󰃗mL的浓度用0.2mol󰃗L硫酸钠溶解,色谱条件:洗脱液为0.2mol󰃗L硫酸钠;流速为0.5mL󰃗min;色谱柱为TSK3000w;检测器,ri.GPC分析软件:符合国家药典标准(龙智达公司).

1.5　UV-Vis吸收光谱取各样品,分别配制1mg󰃗mL水溶液,在贝克曼DU640型紫外蛋白核酸分析仪上做190～700

nm扫描分析.

1.6　1HNMR谱取各样品20mg,经3次D2O(0.5mL󰃗次)

交换;以D2O为溶剂,以DSS为内标,1HNMR谱在

JEOLJNM2ECP600型核磁共振仪上测定.1.7　抗凝活性参照95国家药典,利用PABER󰂪型血小板聚集及血凝测试仪测定.向测试杯中加入经预处理的兔血浆100ΛL,置于(37±0.5)℃下保温5min,然后依次加入3个浓度的标准品(1.000U󰃗mg,

0.8600U󰃗mg,0.7225U󰃗mg)和样品稀释液80ΛL及1%CaCl2溶液20ΛL,立即混匀后加入小磁珠,于血小板聚集及血凝测试仪上测定血凝时间,每个浓度平行测3次,计算抗凝效价.

1.8　活细胞毒性及荧光染色评价在无菌条件下取大鼠胸腺和脾脏剪碎,置于200目不锈钢网上碾磨,用含10%小牛血清的RPMI

1640培养基制成2×106个󰃗mL细胞悬液(脾细胞用溶血素裂解红细胞).以每孔150ΛL接种于96孔

板中.设正常对照组、911组(终浓度100Λg󰃗mL)、9112Tyr2FITC(终浓度100Λg󰃗mL)

组.加药后将

培养板置于37℃、5%CO2培养箱中孵育,24h后加入5mg󰃗mLMTT20ΛL,继续孵育4h,加入150ΛLDMSO,用酶标仪测定OD值.同理制成2×105个󰃗mL细胞悬液,取5mL接种于培养瓶中.设正常对照组、9112Tyr2FITC(

终

浓度100Λg󰃗mL)

组.将培养瓶置于37℃、5%CO2培养箱中孵育,24h后收获细胞,用PBS洗2次

,

重新悬浮于PBS中,用FCM检测.采用488nm的激发光,用FSC󰃗SSC设门去除碎片,FL1通道获取FITC荧光,收集门内10000个细胞进行测定.

2　结果与讨论2.1　911与酪胺的反应911还原性末端单糖残基5位羟基与1位醛基之间形成的半缩醛基,在溶液中存在开环与闭环两种状态的平衡,因此溶液中总是存在一定比例的还原性醛基,该醛基易与酪胺的氨基形成席夫碱,这

5071No.9李福川等:海洋硫酸多糖911的荧光标记研究 一反应过程为可逆反应,大过量的酪胺促使反应向右进行,氰基硼氢化钠可专一地还原席夫碱中的双键,而对糖中的醛基没有作用,且这一还原反应是不可逆的,从而使整个反应体系向产物方向进行[5,6].该反应进行得较缓慢,需要足够长的反应时间.从1HNMR谱中的反应前后911还原端异头氢

的变化及糖醛酸与酪胺的比例分析可知,反应产率约为60%.

2.2　911-Tyr

的荧光标记

9112Tyr中酪胺引入的仲氨基,在弱碱性条件下可与FITC的异硫氰酸中氰基发生亲核反应,生成9112Tyr2FITC,达到对911标记的目的.从1HNMR谱图推算9112Tyr的标记率为80%,标记机理

见Scheme1.

Scheme1　Fluorescentlabelingof911-Tyr2.3

HPSCE

各样品的分析结果见表1.随着911与酪胺及FITC依次偶联,分子量相应增加,如911,9112Tyr

和9112Tyr2FITC的重均分子量(M

{

w)分别为8025,8681和

11582.

Table1　AveragemolecularweightbyHPSECCompoundsM{wM{zM{nPolydispersityP

9118025959861731.309112Tyr86811057065891.329112Tyr2FITC115821452490561.28

2.4　UV-Vis吸光光谱从图1可见,除了在200nm左右处均有911的特征吸收外,9112Tyr在280nm处有酪胺的特征

Fig.1　UV-Visspectraof911,911-Tyrand911-Tyr-FITC

吸收,9112Tyr2FITC在280,450和480nm处分别有酪胺与FITC的特征吸收,这说明酪胺及FITC已被键联到911上,从吸收峰的强度判断其偶联率较高.

2.5　1HNMR谱酪胺和9112Tyr2FITC的1HNMR谱见图2.

比较各谱图可发现,在9112Tyr和9112Tyr2FITC

中均出现酪胺的氢信号.进一步证明两种911衍生物中酪胺的存在.同时比较9112Tyr中酪胺与游离酪胺的相应氢信号的化学位移(表2)可发现,911中酪胺上氢的化学位移发生明显偏移,尤其是H8向低场偏移达0.29,说明酪胺与911之间是共价结合的.此外,9112Tyr与911谱图相比,9112Tyr谱图中∆4.87及5.30处,氢信号明显消失或减弱,而这两个位置正是911还原末端糖醛酸残基异头质子信号区.这进一步说明911的还原端参与了与酪胺的还原胺化反应.在9112Tyr谱中,从酪胺与糖醛酸的比例,结合911还原端异头质子信号的变化,可推断911上酪胺的偶联率约为60%.

Table2　Thechemicalshiftoftyraminein911-Tyrand911-Tyr-FITCbythe1HNMRspectroscopyTyramineresideTyramine∆(1H)9112Tyr∆(1H)9112Tyr2FITC∆(1H)TyramineresideTyramine∆(1H)9112Tyr∆(1H)9112Tyr2FITC

∆(1H)

H2—H67.087.247.24H72.772.822.81H3—H56.706.906.91H83.063.373.35