转移因子资料ppt课件

结论二：
保健品市场中免疫概念已被广泛接受，竞争产品的诉求大同小异， 而转移因子是全新概念，比较之下机会概率较大。
结论三：
金花转移因子口服液；高科技、生物工程技术的占位较高，以非药 非保健品的高新生物制剂切入免疫保健品市场，可以获得最大化的 市场，一旦品牌在市场上被接受，将有长足的发展潜力。
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免
•2、消费者不了解转移因子，缺乏
• 疫类保健品不具备直接诉求的依据）。 • 认同感。
•3、近半专业人士可转移因子可作保健品。
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上海梅高金花转移因子策划案
免疫调节类“保健品”竞争比 较
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上海梅高金花转移因子策划案
•结论思考：
结论一：
单纯进入处方市场难有作为，市场障碍大（来自官方及医学界）。
•障碍： •1、价格相对较高（10元/支/天） •2、不快速显效，无法提供消费者 • 切实可感的表征 •3、消费者对药类的审慎行为
•机会：
•威胁：
•1、消费者接受免疫保健概念（来自市调） •1、市场上免疫类保健品最多且诉
•2、作为药主治不显效，作为保健功能， • 求雷同——“免疫、抗病”，
则
消
• 是直接的免疫增强剂（目前市场上的 • 费者概念混淆。
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上海梅高金花转移因子策划案
•目标论证
目标假设1： ？3亿/年→1%的占有率（3亿/300亿） →前20名的全国品牌→
广告投入30% →9000万元广告费用→全国平均7.5%的市场占有率。 [3亿元/40元/20个（500万以上人口城市）×500万人口]
目标假设2： ？1-2亿/年→0.35-0.67%的占有率→前30名的全国品牌→

第五章 DNA的体外重组与基因转移
目的基因获得了,载体也选好了，下一步的工作就 是将目的基因连接到载体上形成一个重组DNA分子并导 入细胞。
第一节 重组DNA分子的构建
基因重组是依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶 和其他修饰酶的作用，分别对外源目的基因的片段和 表达载体DNA进行适当切割和修饰后，将外源片段和表 达载体巧妙的，再转入受体细胞，实现目的基因在受 体细胞内的。
如下图所示
（一）粘性末端连接法 1. 同一限制酶切位点连接 ③ 存在问题
这种连接方式中，不可避免地会形成载体DNA的 自连和目的DNA的自连，因此，实际操作中必须控制 自我环化现象的发生。
④ 解决方法
通过调节连接反应中外源DNA和载体DNA浓度可以限 制载体DNA自身环化；
（一）粘性末端连接法 1. 同一限制酶切位点连接 ④ 解决方法
（一）粘性末端连接法
1. 同一限制酶切位点连接 ② 举例
如：质粒载体用EcoRⅠ切割后，环状质粒就被切
成具有EcoRⅠ粘性末端的线性质粒；如果外源基因也
用EcoRⅠ切割，并混于上述粘性末端质粒溶液中反应，
则目的基因的两端就会与线性载体两端的粘性末端互
补配对，在连接酶的催化下形成共价连接的环形重组
质粒。
一、在外源目的基因与表达载体连接的重组过程中， 一般需要考虑到以下几个因素：
• 实验步骤简单易行，连接效率较高，易于重组子筛选； • 重组DNA分子，应能被一定的限制性核酸内切酶重新
切割，以便回收插入的外源DNA片段； • 外源基因必须在表达载体DNA的启动子控制之下，并置
于正确的阅读框架之中，以便目的基因的高效表达；
脱离脉冲电场，被击穿的微孔即可复原。然后置于
丰富的培养基中生长数小时后,细胞增殖,质粒复制。

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二、转化的方法
转化大肠杆菌的方法有2类： 1. 感受态细胞法 将宿主细胞制备成感受态，这种细胞容 易接受外源DNA。 2. 电击法（电转化法） 利用电击的方法，在宿主细胞上瞬间打 “洞”，让外源DNA进入细胞内。
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三 感受态细胞的制备
（一）基本概念 由于质粒载体缺失了mob 基因，不能 自行接合转移，必须改变E.coli 质膜的 通透性。 1. 感受态* Compenent 受体细胞经过诱导，产生一种短暂的吸 收外源DNA的生理状态。 2. 感受态细胞 Compenent cells 经物理和化学方法处理，受体细胞膜的 通透性改变，允许外源DNA 进入。
６.符合重组DNA操作的安全标准。
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三、 E.coli受体细胞
1. 特性 用于转化的E.coli 细胞的特点
（1）限制修饰系统缺陷的突变体，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株 （Rˉ，Mˉ），
（2）允许外源DNA 进入E.coli体内，并稳定地遗 传给后代 。
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2. 受体菌的条件与选择 符合生物安全性的要求。 宿主菌的限制酶和重组酶应为缺陷型。 宿主菌处于感受态。 转化率。 3. 常用E.coli菌株 DH5α、DH10B JM101~JM109 其它
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体外包装好的重组噬菌体感染受体菌， 使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。每 g DNA能形成106噬菌斑。 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出 来、再次感染另一（受体）细胞时，发 生在供体细胞与受体细胞之间的DNA 转移及重组。

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图 转导作用
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（3）体外包装的噬菌体的转导
① 体外包装 in vitro ing 定义：将重组的噬菌体DNA或Cosmid 质粒包装成具有感染能力的噬菌体颗 粒。

三、质粒的类型
1、根据遗传学特点： F质粒：性质粒，可转移，与细菌的接合作用 有关； R质粒：耐药性质粒，包括决定抗性转移因子 和抗性因子的DNA； Col质粒：含有合成大肠杆菌基因的质粒；能 产生大肠杆菌素因子（colicin），杀死不含 该毒素的亲缘细菌。
2、根据复制特点：
严谨控制型（stringent contrd type）
3、复制性转座：转位酶分别将供体DNA和受 体DNA靶位点的两条链错位切断，转位因子 的游离端与受体DNA错位切开的突出端分别 连接，在DNA聚合酶催化下以任意一条链为 模板进行复制，完成新的转座成分的复制并 伴有两个复制子的融合，形成共联体。由转 座子编码的解离酶作用于共联体的内解离区， 产生各带有一个转位因子的供体DNA分子和 受体DNA分子。
③转座噬菌体（transposable
phage）
(1)包括Mu和D108两种噬菌体，是一类温和噬菌体*。 (2)感染细菌后，可以整合到细菌染色体中，插入位 点是随机的（而入phage插入位点是专一的），可 以插到结构基因内部，引起突变，Mu即Mutator(突 变子)因此得名。 (3)插入部位的2侧有短的DR，插入时，一个拷贝留 在原位，新合成的拷贝插入新的部位。 (4)和IS，Tn相比，Mu末端不含IR，这是可转座成 分的一个例外。

1、同源重组 同源重组：发生在DNA的同源序列之间，涉及的是大片段同 源DNA序列的交换。 同源重组要求交换的两条DNA序列相同或十分接近，交换位 点随机。 2、位点特异性重组 位点特异性重组：不依赖于DNA序列的同源性，而是有赖于 能与某些酶相结合的特异DNA序列的存在。 二者的区别：前者的重组位点是随机的，后者重组发生于特 异序列；前者重组后DNA序列保持原有次序，后者会发生序 列重排。 3、转座作用 4、异常重组