食品发酵院“发酵法制备甘露醇技术的开发”项目通过验收

抗生素的发酵生产

抗生素的发酵法生产

摘 要:对马杜霉素，螺旋霉素，农用抗真菌素的发酵生产，确定其最佳的发酵

条件，并且对其各自发酵工艺进行比较，深入的了解用发酵法产抗生素

的原理及方法。

关键词:马杜霉素 螺旋霉素 农用抗真菌素 发酵生产

引言

采用发酵工程技术生产医药产品是制药工程的重要部分，其中抗牛素是我国医药生产的大宗产品，随着基因工程技术的进展，基因工程药的比例逐渐增大。但抗生素在国计民生中所起的作用是能完全替代的。特别是西方同家出于能源和环保的考虑，转产生产高附加值的药物，留出厂抗生素的市场空间，为我国的抗生素生产发展提供了机遇，作为一个发展中的国家，可以说在相当长时间内，我国抗生素生产在整个医药产品巾仍占很大的比例，因此抗生素类发酵过程优化技术研究对医药行业的生产具有重要的经济和社会意义。

抗生素发酵过程优化研究中主要存在的问题

长期以来为提高抗生素发酵水平，把注意力主要放在菌种筛选与改造，或从国外引进菌株。近年来，随着现代牛物技术的日益发展，尤其是基因工程和代谢1:程技术的发展，已经取得了引入注目的效果，主要有:(1)将生物合成途径中关键酶基因克隆来改良现有抗生素生产菌种;(2)将抗生素生物合成产生副产物的酶基因敲除，以提高产生抗生素的能力;(3)克隆外源基因以改良原菌种的发酵生理特性;(4)克隆外源抗生素合成基因簇来合成新的抗牛素等，但是在通过各种方法得到一个高产菌株后，在实际发酵操作时，往往忽视厂生物反应器中上程问题所必须加以考虑的工艺变化和过程优化。随后的逐级放大与优化基本上是以最佳工艺控制点为依据，采用人工经验为主的静态操作，在方法上基本以正交试验为基础。因此，发酵过程优化与放大始终是生化上程中一个复杂问题的两个侧面，人们从不同的角度进行研究。此外，随着计赞机技术的迅速发展，各抗生素发酵工厂已普遍采用计算机在线控制，主要在补料操作上采用杯式流加技术，

基本上满足了抗生素工业发酵生产上所需要的高精度控制补料速率问题，对提高发酵效价起了重要作用。但由于对抗生素发酵过程的认识不能深入，对操作条件变化的适应能力差，为此，许多抗生素发酵工厂在生产罐上义进一步配置了溶氧电极、DH电板，甚至排气氧和二氧化碳浓度测量。但对测量参数及其变化的意义缺乏理解(由于以动力学研究为根据的反应器设计原理的局限性，不能深入解释。例如发酵过程溶氧变化意味着什么?是基因水平，细胞水平，还是反应器工程水平问题。大多仅停留在经验法则，缺乏过程分析的理论指导，因此，计算机控制只能解决批间操作的不稳定问题，对发酵获得的高效价批号不能总结，一个新品种的投产仍需很长时期，实际效果不明显。因此，在综合各种检测参数的基础上，提出发酵过程的优化控制理论，切实可行地解决工业生产中实际问题就成为当前业发酵迫切需要解决的重要课题。

维生素 维生素类生产工艺 维生素是一类生物生长和代谢所必需的、具有特殊功能的小分子有机化合物，其既不是细胞的组成物质，也不是能量物质。一般分为脂溶性和水溶性两大类，脂溶性维生素在体内可直接参与代谢的调节作用，而水溶性维生素是通过转变成辅酶对代谢起调节作用。不同的维生素对物质代谢的调节作用是不同的。机体缺少某种维生素时，可使物质代谢过程发生障碍，从而使机体不能正常生长，以至发生不同的“维生素缺乏症”。例如，缺乏VBl可引起脚气病，缺乏VA会引起夜盲症，缺乏维生素VC会引起坏血病等，总之，维生素在维持机体的代谢中起着十分重要的作用。 一、维生素C ( Vitamin C，VC) 维生素C又名抗坏血酸(Ascorbic acid)，呈白色粉末，无臭，味酸，熔点190～192℃，易溶于水和甲醇，略溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿及石油醚等。具有较强的还原性，易受光、热、氧等破坏，在碱液中或有微量金属离子存在时，分解更快，但干燥结晶后较稳定。VC是一种人体必需的水溶性维生素，也是一种抗氧化剂，广泛应用于医药、食品、饲料等领域。 维生素C的合成常通过化学或微生物方法获得，下面介绍主要的维生素C合成法。 1. 莱氏法 1933年瑞士化学家莱齐特因等用化学合成方法合成维生素C取得成功，也称莱氏法。该法是最早生产维生素C的方法，也是国外采用的方法。工艺路线如图8-1所示。

工艺流程如下： （1）菌种的获得 以D-葡萄糖为原料，加氢催化生成D-山梨醇，再加入醋酸菌如D-葡萄糖 D-山梨醇 L-山梨糖 双丙酮-L-山梨糖 双丙酮-2-酮基-L-古洛糖酸 2-KGA 维生素C H2/催化剂 发酵氧化 丙酮/硫酸 次氯酸钠 硫酸镍 H3O+ 化学转化 图8-1 莱氏法合成维生素C的工艺路线 Acetobacter suboxyclans、A．raucons、A．aceti、A．Xylinoides等将山梨醇氧化成山梨糖，常使用的是A．suboxyclan和A．melangenum，这是该工艺过程中关键的一步。 （2） 第一步发酵 a. 在进行发酵时采用的条件是温度为26～30℃，最适pH值为4.4～6.8。 b．培养基的成分： 0.5％酵母浸膏为主要营养源，山梨醇浓度为19.8％，通气量比1:1.8，30℃培养30～40h，收率可达97.6％。可采用流加山梨醇的方式发酵；有机氮提供氮源。 发酵结束后经低温灭菌，得到无菌的发酵液用于第二步发酵。 （3） 第二步发酵 将氧化葡萄杆菌或假单胞杆菌经过二级种子扩大培养转移至含有上述发酵液的培养基中，于发酵罐28～34℃培养60～72h，发酵液转化，精制，获得维生素C。 注意在发酵过程需采用阳离子交换树脂将山梨醇中的金属离子去掉，因为Ni2+，Cu2+阻止菌的发育，Fe抑制发酵。 该法生产的维生素C产品质量好、收率高，达60％，而且生产原料易获得，中间产物化学性质稳定，一直是国外生产维生素C的重要方法。此法也存在着很多缺陷，如生产工序繁多、劳动强度大、大量有机溶剂的使用易造成环境污染等。 ２. 二步发酵法 二步发酵工艺是中国科学院微生物研究所和北京制药厂于1975年合作发明的，此法进一步发展了维生素C的生产，是目前唯一成功应用于维生素C工业生产的微生物转化法。工艺路线如图8-2所示。

实验项目一：稀奶油的分离与原料乳的标准化

一、目的与要求

1．了解稀奶油的分离过程；

2．理解稀奶油分离原理和原料乳标准化方法；

3．并掌握所使用的仪器及设备。

二、材料与设备

1、原料

表 原料

名称 数量 名称 数量 名称 数量

商品牛奶 50斤/班

2、器材

表 器材

名称 规格 数量 名称 规格 数量 名称 规格 数量

牛乳分离机 3台/班 温度计 0-100℃ 1支/班 量筒 100mL 1个/班

水浴锅 1台/班 纱布 1包/班 量筒 50mL 1个/班

电炉（含铝锅） 1台/班 塑料杯 1L 2个/组 烧杯 500mL 2个/班

三、实验原理

稀奶油是用鲜乳分离而得，乳中脂肪的密度为0.93，脱脂乳的密度为1.034，利用它们之间的密度差，可以从乳中离心分离制备稀奶油。

四、内容与方法

1 分离机的安装

1.1 先将机身牢固地安装在平稳的台架上，用水平尺调平。

1.2 传动装置加注润滑油，加油方法见图1。

1.3 将分离钵按图2所示部件组成顺序安好后在将其安放在立轴上，是底部孔内的销子卡入立轴之缺 图1 传动装置加油

口内。

1.4 在依次安装好流奶器（脱脂乳收集器），漏斗座，流油器（稀奶油收集器），漏斗，乳飘（浮子与浮子室）盛奶桶（受乳器）及开关（见图3）浮子有三个凸台之面应向下，开关应关闭。稀奶油排出孔之位置应高于流油器顶端1.5～2mm。

1.5 分离机安装好以后，转动手柄（先慢后快，使之在2～3min内达到额定转速）检查安装质量，如有摩擦现象应立即调整或安装。

2 乳的分离

2.1 于受乳器上盖一块数层纱布，在于两个收集器下各放置一个容器用以接收分离的脱脂乳和稀奶油。同时将乳预热至35～40℃。

2.2 分离机预热：启动分离机，待其达到规定转速后将40～50℃热水到入受乳器内，打开开关，热水进入分离机钵内进行预热，当水流出停止后关闭开关。

悦澡蚤灶葬月则藻憎蚤灶早圆园19Vol.38晕燥援10杂藻则蚤葬造晕燥援332

脂肪酶（lipaseEC3.1.1.3）是一类能催化甘油酯水解的酶的总称，催化效率高，副产物少，反应条件温和，不需要辅酶或辅因子的参与，已在合成反应、生物燃料、制药工业以及洗涤剂、食品、纺织等领域得到广泛应用。脂肪酶不仅能催化甘油酯类水解与合成，还能催化酯化反应、酯交换反应、醇解反应，促进多肽、表面活性剂和药物等的合成反应[1]。微生物脂肪酶的研究始于20世纪初，经过100多年的研究，目前已经成为脂肪酶的主要来源。特别是近几十年来，随着高效筛选技术和先进基因工程技术的应用，已经实现了曲霉、毛霉和假单胞菌的相对高产，并且部分菌株已经实现工业化应用[2]。我国高质量的脂肪酶产生菌种类少，产量低，很多企业不得不依赖价格昂贵的进口脂肪酶，因此筛选和培育高产优势脂肪酶产生菌显得尤为重要[3]。另外，脂肪酶催化的反应类型和条件多种多样，不同类型的脂肪酶应用方向千差万别，因此筛选不同来源的脂肪酶是脂肪酶研究的基础。微生物脂肪酶的表达主要受环境因子的调节，产脂肪酶微生物需要以油脂和脂肪酸作为碳源生长，因此常用的微生物筛选来源包括油脂加工厂、乳制品工厂以及附近被油脂污染的土壤和水域等[2]。芽孢杆菌是一类潜在的优良脂肪酶生产菌株，目前用于生产脂肪酶的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌[4]、蜡状芽孢杆菌[5]、类芽孢杆菌[6]和地衣芽孢杆菌[7]等。枯草芽孢杆菌所生产的脂肪酶属于胞外酶，便于下游分离纯化，适用于大规模工业化生产[8-9]，并且普遍具有较高的碱耐受力[10-11]，在洗涤剂和纺织等领域市场需求巨大。本研究从油脂污染水样中分离出一株产脂肪酶菌株，对其进行形态学特征、生理生化试验及分子生物学鉴定，并通过单因素试验和响应面试验对其发酵培养基组分进行优化，旨在提高脂肪酶产量，进一步对其酶学性质研究提供技术参考和实验基础。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1材料从曲阜市多个食堂和食品厂附近被油脂污染的下水产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及发酵培养基优化贺秋红袁巩志金*袁颜梅渊曲阜师范大学生命科学学院袁山东曲阜273100冤摘要：该研究从自然界筛选出一株脂肪酶产生菌株，鉴定其种属并对其发酵培养条件进行研究。采集富油水样，利用罗丹明B培养基进行初筛，结合形态观察、生理生化试验和16SrDNA序列分析进行菌种鉴定，建立系统发育树。结果表明，筛选出一株产脂肪酶的细菌U5，经鉴定为枯草芽孢杆菌（）。通过单因素试验和响应面试验设计对发酵培养基中三丁酸甘油酯、葡萄糖、尿素添加量进行发酵优化。结果表明，最佳的发酵培养基组分为：三丁酸甘油酯2.0%（/），葡萄糖9g/L，尿素8g/L。在此优化条件下，粗脂肪酶酶活为4.3U/mL，比优化前的酶活提高了16.22%。关键词：脂肪酶；菌株筛选；枯草芽孢杆菌；发酵培养基；优化中图分类号：TQ920.6文章编号：0254-5071（20员9）10-0084-05doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2019.10.017引文格式：贺秋红，巩志金，颜梅.产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及发酵培养基优化[J].中国酿造，2019，38（10）：84-88.HEQiuhong,GONGZhijin*,YANMeiAlipase-producingstrainwasscreenedfromnature,thespecieswasidentifiedandthefermentationconditionswerestudied.Theoil-richwatersampleswerecollectedandthestrainwasscreenedbyrhodamineBmedium.Thestrainwasidentifiedbymorphologicalobservation,physiologicalandbiochemicaltestand16SrDNAsequenceanalysis,andthephylogenetictreewereestablished.Theresultsshowedthatalipase-producingbacteriumU5wasselectedandidentifiedas.Thefermentationmediumformulawasoptimizedbysinglefactorandresponsesurfacemethodologyasfollows:tributyrin2.0%(/),glucose9g/Landurea8g/L.Underthecondition,thelipaseactivitywas4.3U/ml,whichwas16.22%higherthanthatofbeforeoptimization.lipase;strainscreening;;fermentationmedium;optimization