链霉菌操作手册

链霉菌室实验操作手册（2003 年）第一章培养基抗生素生长因子 (3)常用抗生素及其使用浓度 (3)LB （Luria-Bertani ）培养基 (3)LA (3)基本培养基（MM ） (3)R5（1L）链霉菌原生质体转化时用 (4)YEME（酵母膏-麦芽膏培养基）1L （液体培养链霉菌） (4)TSBY （1L）（液体培养链霉菌） (4)MS培养基 (5)2CMY 培养基（用于井岗的接合转移） (5)YMS培养基（阿维，井岗产孢） (5)YD培养基 (5)生长因子补充物的使用浓度 (6)第二章DNA 基本操作 (7)大肠杆菌质粒的抽提 (7)酶连反应 (7)DNA片段凝胶回收 (8)DNA纯化 (9)E.coil总DNA的提取 (9)链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进） (10)去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明） (10)AT克隆（详见说明书） (10)Souther n Blot (11)第三章PCR及相关技术 (13)PCR (13)PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429重叠延伸技术） (14)PCR定点诱变（Dpnl法） (14)第四章基因片段转移技术 (15)大肠杆菌CaCl 2法制备感受态细胞及DNA转化 (15)DNA转化 (15)大肠杆菌质粒的快速检测 (15)接合转移（详见英文《手册》249页） (16)链霉菌原生质体的制备 (16)链霉菌原生质体的转化 (17)PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化 (17)第五章RNA操作技术 (19)链霉菌总RNA的抽提 (19)链霉菌的RT-PCR （promega RT kit ） (19)第六章蛋白质基本操作技术 (21)SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色 (21)大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）： (21)链霉菌总蛋白扌由提： (22)大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）： (22)Western Blot (23)第七章遗传作图相关技术 (25)链霉菌孢子悬液的制备 (25)链霉菌中NF的证明 (25)孢子杂交 (25)在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因 (25)第八章其他技术 (27)链霉菌菌种保藏 (27)检测链霉菌淀粉酶的活性 (27)第一章培养基抗生素生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度（mg/ml）MM 使用终浓度（卩链霉菌g/ml）大肠杆菌LA 或LB 2CM YBME氨苄青霉素Ampicillin, Amp bla100R R R50-100氯霉素Chloramphenicol, Cml cat25（无水乙醇配）10——25潮霉素Hygromycin, Hyg hyg501025—50卡那霉素Kanamycin, Km aac 或aph252?50—50壮观霉素Spectinomycin, Spc aadA5050505050链霉素Streptomycin, Str str501025—25硫链丝菌素Thiostrepton, Thio tsr25(DMSO 配)510 2.5不敏感红霉素Erythomycin, Ery ermE100100——20阿泊拉霉素Apramycin, Am aac (3) IV5010505030-50 *-表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！！！*R表示不敏感*Km和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。

*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。

*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, VioLB（Luria-Bertani ）培养基胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为 1.5-2%的琼脂粉（不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%）。

*做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO4・7H2O 0.2g,FeSO4 -7H2O 0.01g,蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有 2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50 % 葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。

配置MM 的琼脂有lab agar、Ice agar（IA）R5（ 1L）链霉菌原生质体转化时用蔗糖K2SO4MgCl 2 • 6H2O葡萄糖Difco酪蛋白氨基酸微量元素溶液Oxoid酵母提取物TES加蒸馏水至103g 0.25g 10.12g 10g 0.1g2ml5g 5.73g 1000ml称取5.5g Difco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。

使用时，将培养基融化，每瓶中加入：KH 2PO4(0.5%) CaCl2 ・2H2O(5M) L-脯氨酸(20%)2.5ml 1ml3.75mlNaOH（1M）调pH 至7.3对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》）YEME酵母膏-麦芽膏培养基）1L （液体培养链霉菌）Oxoid酵母提取物3gOxoid 蛋白胨Tryptone 5g麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630）3g葡萄糖10g蔗糖* 340g蒸馏水至1000ml高压灭菌后加入：（8磅灭菌，113- 114° C, 15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。

）MgCl 2 • 6H2O（2.5M）2ml/L制备原生质体时，还要加入：甘氨酸（20%）* 25ml/L*蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。

*甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。

TSBY （1L）（液体培养链霉菌）Oxoid胰胨豆汤粉（TSB）30g蔗糖* 340gOxoid酵母抽提物5g蒸馏水至1000ml*不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。

培养基将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时，用纱布过滤得到滤液，将每250ml滤液分装到装有5g 琼脂，5g甘露醇的500ml三角瓶中，10磅灭菌，使用时调pH7.2-7.3。

2CMY培养基（用于井岗的接合转移）可溶性淀粉10g胰蛋白胨2gNaCl1g(NH4)2SO42gK2HPO41gCaCO32g无机盐溶液* 1 ml琼脂20g蒸镏水1000 mlPH7.2无机盐溶液（每升）FeSO4 .7H2 O1gMgCl.6 H 2 O1gZn SO4. 7H2 O1gYMS培养基（阿维，井岗产抱）酵母抽提物4g可溶性淀粉4g麦芽糖10gCoCl. .6 H2 O5mg琼脂20g蒸镏水1000 mlPH7.2YD培养基酵母抽提物4g麦芽糖10g葡萄糖4gMgCl2gCaCl 1.5g琼脂15g蒸镏水1000 mlPH7.2生长因子补充物的使用浓度天蓝色链霉菌1258、J1501等都是营养缺陷型菌株，培养这些菌株时一般需向培养基中补加营养因子，使用浓度如表生长因子补充物的使用浓度表化合物储存液（mg/ml）1终作用浓度（卩g/ml）组氨酸（Histidine）1050其它氨基酸27.537腺嘌呤，鸟嘌呤， 1.57.5胸腺嘧啶，尿嘧啶维生素0.10.51.储存液用无菌去离子水配置，8磅火菌后4°C保存。

2.对于半胱氨酸营养缺陷型菌株，补充光氨酸。

第二章DNA基本操作大肠杆菌质粒的抽提苯酚/氯仿溶液抽提法1. 接种5ml LB，37C摇床过夜培养（12小时）2. 离心，3000rpm, 5min去上清3. 振荡混匀沉淀，分装在2个离心管中，spin 一下，吸去上清，加入150卩I的溶液I（50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris CI（PH8.0）, 10mmol/L EDTA（PH8.0）在10lbf/in2 （6.895 x 104Pa）高压蒸气下灭菌15min （8磅），贮存于4C）,剧烈振荡5分钟打散菌体（菌体不打散容易在产物中出现较多蛋白）。

4. 加入300卩l溶液II （0.2mol/LnaOH, 1%SDS,用2倍的溶液现配现用）后立即振荡混合均匀，处理2分钟后加入225卩l溶液111（ 5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml）混合均匀，12000rpm离心5min，取上清液中于新的离心管。

5. 加120卩l酸性苯酚/氯仿溶液，振荡混匀，12000rpm离心5min ,再取上清液中于新的离心管中。

6. 用120ul氯仿重复操作5。

7. 加等体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混匀，12000rpm离心7min。

8. 沉淀用70%乙醇洗涤两次，每次10min。

50C烘干后加适量无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20 C保存。

氯化锂抽提法1. 前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用Solution I II III处理）2. 加等体积的异丙醇，混匀，沉淀DNA , 12000rpm离心7min。

去上清，尽量去干净。

3. 用少量70%乙醇洗一下（洗去异丙醇），离心去尽酒精，50C烘干沉淀，用适量ddH2O（100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）后加入4/5体积的氯化锂溶液（浓度约10mol/L ）处理1min沉淀RNA和蛋白。

4. 12000rpm离心5min，取上清液于新的离心管中，用等体积的异丙醇混匀，12000rpm离心8min，去上清。

5. 将沉淀用70%乙醇洗涤两次，每次10min。

50C烘干后加一定量的无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20 C保存。

酶连反应一般米用10卩l反应体系：T4连接酶1卩I ,连接酶缓冲液1卩I ,外源片段与载体按DNA摩尔含量3:1加入即可。

如果是粘端连接，则需把外源片段和载体的混合物在50度处理10分钟使粘端变性，然后立即放入冰中5分钟。

平端连接采用14度，粘端连接采用16度，连接4小时以上（一般可过夜）。

*外源片段与载体按DNA摩尔含量为3:1或外源更多。

DNA 片段凝胶回收1试剂盒回收（离心法）（详见说明书）（1）在长波紫外灯下切下含有目标 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小 ,该重量作为一个凝胶体积 ，加DE-A 液 DE-A 溶液体积3个凝胶体积 个凝胶体积 个凝胶体积混匀后于75o C 加热,（低熔点琼脂糖凝胶于 45o C 加热），间断混合，直到凝胶熔化（6-8分钟）. （3）加0.5个DE-A 体积的DE-B 溶液，混匀（是否需调整PH 值，见注意事项1）;当分离的DNA 片段小与400bp 时加入异丙醇至终浓度为20%;⑷ 吸3中的混合液，转移到DNA 制备管,3600rpm 离心1分钟.如制备管中有残留，适当提高 速度,再离心1分钟，去滤液；⑸ 将制备管置回离心管，加0.5ml W1溶液,3600rpm 离心30,弃滤液；⑹将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液,3600rpm 离心30,弃滤液，重复一次；（W2中含有 酒精，应保证瓶子密封。