基于高通量测序的结直肠癌 miRNA表达谱分析

・６ｌ８・　ｄｏｉ：１０．１３７０５／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１—６８２５．２０１５．０５．００７　学堂报（医学版）　２０１５年９月　第５０卷第５期　

基于高通量测序的结直肠癌ｍｉＲＮＡ表达谱分析　梁高峰　＇　，李俊生　，何向峰¨，陈宝安　１）东南大学医学院附属中大医院血液科南京２１０００９　２）河南科技大学医学技术与工程学院洛阳４７１００３　３）东南大学医学　院附属中大医院普外科南京２１０００９　＃通信作者，男，１９５８年１月生，博士，主任医师，研究方向：血液病诊断与治疗、肿瘤生物治疗，Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｂａ８８８８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｓｏｒｅ　

关键词微小ＲＮＡ；结直肠癌；表达谱；调控网络　中图分类号Ｒ７３５．３　摘要　目的：研究结直肠癌组织中ｍｉＲＮＡ表达谱的差异及其相关信号通路。方法：采用ＳＯＬＩＤ高通量测序技　术对ｌ０例结直肠癌组织和１Ｏ例癌旁正常组织进行测序，然后利用生物信息学方法分析ｍｉＲＮＡ—ｍＲＮＡ相互作用的　通路。结果：筛选出１９４个结直肠癌差异表达的ｍｉＲＮＡ，这些ｍｉＲＮＡ广泛参与基因表达的转录后调控，如ＭＡＰＫ、　ＷＮＴ、ＴＧＦ—Ｂ信号通路。结论：结直肠癌ｍｉＲＮＡ的差异表达可能暗示着有不同功能或来源的ｍｉＲＮＡ通过调控不同　的靶基因来协同、精细调控某些特定的信号通路。　

Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｉＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｈｉｇｈ—ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　

ＬＩＡＮＧ　Ｇａｏｆｅｎｇ　，　，ＬＩ　Ｊｕｎｓｈｅｎｇ　，ＨＥ　Ｘｉａｎｇｆｅｎｇ　，ＣＨＥＮ　Ｂａｏ　ａｎ　’　）Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｚｈｏｎｇｄａ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａ　ｎｇ　２１０００９　２）Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｏｙａｎｇ　４７１００３　３）Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｚｈｏｎｇｄａ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｎａｎｊｉｎｇ　２１０００９　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ；ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ；ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｎｅｔｗｏｒｋ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ａｉｍ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｍｉＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃ—　ｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＳＯＬＩＤ　ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｍｉＲ—　ＮＡ　ｉｎ　ｔｈｅ　１０　ｐａｉｒｅｄ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ（１０　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ａｎｄ　１０　ｔｕｍｏｒ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ｎｏｒｍａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ），ｔｈｅｎ，ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｔｈｅ　ｍｉＲＮＡ—ｍＲＮＡ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｍｉＲＮＡ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｍｉＲＮＡ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１９４　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｍｉＲＮＡ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｍｉＲＮＡ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ　ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ＭＡＰＫ，ＷＮＴ，ＴＧＦ—Ｂ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：　Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｍｉＲＮＡ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｍａｙ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｉＲＮＡ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｒ　ｆｒｏｍ　

国家自然科学基金资助项目８１３７０６７３，Ｕ１４０４８２４；河南科技大学青年科学基金资助项目２０１３ＱＮ４４　［１２］楚新梅，李小鹰，梁春红，等．雄激素及其受体和雌激素　变化在老年男性高血压患者中的初步研究［Ｊ］．中华老　年心脑血管病杂志，２００７，９（２）：９８　［１３］吕颖，孙超峰，张军波，等．自发性高血压大鼠大、中动　脉壁ＡＴ１和ＡＴ２受体表达的增龄性变化［ｊ］．西安交通　大学学报：医学版，２０１２，３３（５）：５９８　［１４］Ｗａｎｇ　ＪＭ，Ｗａｎｇ　Ｙ，Ｚｈｕ　ＺＳ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｖｅｒｓｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｏｎｇ—　ｔｅｒｍ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｉｍｉｄａｐｒｉｌ　ａｎｄ　ｉｒｂｅｓａｒｔａｎ　ｏｎ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　

ｓｉｇｎａｌ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅ　１　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｅｆｔ　ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ　ｏｆ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ，　２００４，７５（４）：４０７　［１　５］Ｅｄｗａｒｄｓ　Ｊ，Ｂａｒｔｌｅｔｔ　ＪＭ．Ｔｈｅ　ａｎｄｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｎｄ　ｓｉｇｎａｌ—　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｉｎ　ｈｏｒｍｏｎｅ－－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｅａｎｃ‘‘　ｅｒ．Ｐａｒｔ　１：ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｎｄｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ［Ｊ］．ＢＪＵ　Ｉｎｔ，２００５，９５（９）：１３２０　（２０１５—０１—０７收稿责任编辑徐春燕）　・６１９・　微小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，简称ｍｉＲＮＡ）是真核生　物内源性的小分子非编码ＲＮＡ，能够通过转录后水　平调节基因的表达。人ｍｉＲＮＡ总数可能占总基因　数的１％，人类全部基因的１／３可能受ｍｉＲＮＡ的调　控…。研究证实，ｍｉＲＮＡ与多种疾病有关，如糖尿　病　、心脏病　、癌症　、神经系统疾病　等。该研　究采用ＳＯＬＩＤ高通量测序技术分析了１０对癌组织　和癌旁正常组织ｍｉＲＮＡ表达谱，筛选出两者间的差　异ｍｉＲＮＡ，利用数学模型来综合分析这些差异表达　的ｍｉＲＮＡ对其靶ｍＲＮＡ的调控作用及结直肠癌组　织中受ｍｉＲＮＡ调控的ＫＥＧＧ通路和ＧＯ生物过程，　为进一步研究结直肠癌发生发展的机制提供理论　依据　１　材料与方法　１．１　材料　１．１．１　标本来源　收集东南大学附属中大医院组　织库２０１０年至２０１１年存档的冰冻组织标本２０例，　包括结直肠癌组织１０例、癌旁正常组织１０例，均参　照文献［６］标准进行诊断和分类。　１．１．２　主要试剂Ｔｒｉｚｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ，德国），ｍｉｒＶａｎａ　ｍｉＲＮＡ提取分离试剂盒（Ａｍｂｉｏｎ，美国），ＳＯＬＩＤ　小　ＲＮＡ表达检测试剂盒（Ａｍｂｉｏｎ，美国）。　１．２　总ＲＮＡ提取及质量鉴定　将每个冰冻组织　标本切５～６片，片厚８　ｍ，用Ｔｒｉｚｏｌ提取总ＲＮＡ，　然后用ｍｉｒＶａｎａ　ｍｉＲＮＡ提取分离试剂盒分离小　ＲＮＡ，总ＲＮＡ完整性采用１０　ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳　鉴定。　１．３　ＳＯＬＩＤ测序及分析使用ＳＯＬＩＤ　小ＲＮＡ表　达检测试剂盒将样品中的小ＲＮＡ转换成双链的ｃＤ—　ＮＡ。为避免小ＲＮＡ样品提取过程中产生的ｍｉＲＮＡ　前体断裂片段的影响，将这些比对上的片段再与　ｍｉＲｂａｓｅ数据库中的成熟ｍｉＲＮＡ序列进行最后的比　对，从中筛选出ｍｉＲＮＡ及其ＳＯＬＩＤ测序片段数。　１．４　基于测序数据的数学模型的构建　借助ｍｉＲ—　ＮＡ靶基因预测数据库ＰｉｃＴａｒ（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃｔａｒ．ｂｉｏ．　ｎｙｕ．ｅｄｕ），获得结直肠癌组织中所检测到的ｍｉＲＮＡ　的所有靶基因，使用公式［１］计算所有测序得到的　ｍｉＲＮＡ对ｍＲＮＡ的抑制率。　

Ｒ　＝［∑（Ｃｏｕｎｔ　ＲＭ　／ｎ　）×ｗｅｉｇｈｔ］／Ｎ　。　［１］　其中，Ｒ　表示ｍｉＲＮＡ对靶ｍＲＮＡ　的抑制率；　分；Ⅳ　小ＲＮＡ样品中所检测到的总ｍｉＲＮＡ数量。　Ｃｏｕｎｔ　表示所有测序ｍｉＲＮＡ中第ｉ个ｍｉＲＮＡ的　结直肠癌组织中，所有ｍｉＲＮＡ集合对靶ｍＲＮＡ　数量；　，调控ｍＲＮＡ　的ｍｉＲＮＡ数量，ｉ＝１，２，３，……，　抑制率差异的比较采用Ｚ—ｔｅｓｔ方法　７－８１。Ｐ。假设使　ｚ；ｎ　ｍｉＲＮＡｉ的靶ｍＲＮＡ的数量；ｗｅｉｇｈｔ，ＰｉｃＴａｒ得　用如下公式计算：　

。　（ＲｍＲＮＡ　‘Ｎ　。　。　）　＋（Ｒ　ＲＮＡ　‘Ｎ　。　。ｆ）…　。　ｒ，，］　。　一　Ⅳ　＋Ⅳ　

。￡　Ｌ　Ｊ　

Ｚ　＝　———　兰二三　竺兰兰兰二二—一　［３］　Ｐ。　（１一Ｐ０　）／Ｎ　。ｆ　＋Ｐ０　（１一Ｐ０　）／Ｎ　ｆ　。　当Ｚ＞１．９６或＜一１．９６，拒绝尸ｎ假设，则结直肠　癌组织中ｍｉＲＮＡ对ｍＲＮＡ的抑制率与癌旁正常组织　比较，差异有统计学意义。　１．５　ＤＡＶＩＤ分析根据所有ｍｉＲＮＡ集合对ｍＲ－　ＮＡ的整体抑制情况，获得表达水平受ｍｉＲＮＡ影响　的蛋白。采用ＤＡＶＩＤ分析这些蛋白对ＫＥＧＧ通路　和ＧＯ生物过程的影响。　２　结果　２．１　ＳＯＬＩＤ测序结果　结直肠癌组织和癌旁正常　组织中小ＲＮＡ片段占１．１３％和１．１４％。比对结果　表明，每个样本所比对上的片段数都达１０　以上，长　度为２１～２４　ｎｔ，尤以２２　ｎｔ的片段最多（图１）。结　

直肠癌组织和癌旁正常组织所得测序片段的分布具　有明显的相似性，而成熟ｍｉＲＮＡ的序列长度集中分　布在ｌ８～２４　ｎｔ。结直肠癌组织和癌旁正常组织中　分别检出６２７和４５１个ｍｉＲＮＡ（表１）。　２．２　结直肠癌组织中差异表达的ｍｉＲＮＡ　结果见　图２。结直肠癌组织中表达上调的ｍｉＲＮＡ中，４６个　ｍｉＲＮＡ的表达高于２倍；表达下调的ｍｉＲＮＡ中，８４　个ｍｉＲＮＡ的表达低于１／２。　Ｚ—ｔｅｓｔ结果（图３、表２）表明，结直肠癌组织中　较多的ｍｉＲＮＡ表达水平受到影响。超过１／２（１９４／　３１３）的ｍｉＲＮＡ表达差异明显，其中８０个ｍｉＲＮＡ表