多酚氧化酶的制备和性质研究

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。

由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。

自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。

多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶。

多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。

在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。

在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。

现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。

编辑本段二、多酚氧化酶在自然界的分布1植物中的多酚氧化酶及作用在植物(如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、桑叶、烟草等)组织中，PPO是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后PPO被活化，从而表现出活性。

在果蔬细胞组织中，PPO存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PPO活性大部分存在于叶绿体内[7]；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PPO，含量大约与蛋白质部分相同[8]；在茶叶中的PPO 分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PPO，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态[9]，ThanarajS.N.(1990)研究了茶树新梢中PPO活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现PPO活性强，多酚含量高，对红茶品质有利，相反则利于绿茶的生产[10]；新鲜的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。

多酚氧化酶特性研究摘要: 采用分光光度法, 对板栗仁多酚氧化酶( PPO) 的催化特性、最适波长、最适反应时间、最适温度、最适pH 值、热稳定性等性质进行了研究, 同时研究了Vc、EDTA、NaCl、柠檬酸4种添加剂对板栗仁多酚氧化酶活性的影响。

结果表明: 板栗仁多酚氧化酶催化氧化产物的最大吸收波长为410nm, 最佳反应时间为3min, 最适反应温度为30℃ , 最适pH 值为6. 0, 米氏常数Km = 0.0694mo l/L, Vmax = 3.918OD/min。

95℃水浴处理5min该酶已基本失活, 其中V c和EDTA对板栗仁多酚氧化酶酶促褐变有很好的抑制效果。

关键词: 板栗; 多酚氧化酶; 褐变; 抑制多酚氧化酶( Polyphenolox idase, PPO ) 是由核基因编码的铜金属酶, 其酶促褐变机制是: 内源性酚类物质在多酚氧化酶的催化下氧化生成醌, 醌再相互作用生成高分子聚合物, 从而导致褐色素的生成。

它能催化两类不同的反应, 可以使一元酚羟基化, 生成相应的邻二羟基化合物;也可以氧化邻苯二酚生成醌[ 1]。

而酚类物质是果疏组织褐变的物质基础, 不同植物、同一植物的不同组织, 同一植物的不同品种、生长环境以及不同的发育期, 其褐变的主要酚类物质均有所不同, 导致酶褐变活性也有所差异。

云南富产板栗, 但对板栗仁PPO 的活性及影响活性因素的研究则未见报道。

1材料与方法1.1材料板栗市场购外观良好, 无病虫害, 无机械损伤新鲜的云南板栗。

1.2试剂与仪器主要试剂: 聚乙烯吡咯烷酮( PVPP)、邻苯二酚、乙酸钠、冰乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇、乙醛、盐酸、维生素C ( V c)、EDTA、柠檬酸、氯化钠等, 均为国产分析纯。

主要试验仪器: TGL - 16G 高速台式冷冻离心机、722W 型分光光度计、HH - 4型数显恒温水浴锅、冰箱等。

1.3试验方法1.3.1粗酶液的制备酶液提取参照文献[ 2] 的方法, 有所改进。

多酚氧化酶的分离纯化、蛋白质含量、活性测定及电泳博哥(中山大学化学与化学工程学院，广州510275)摘要多酚氧化酶与植物组织培养的酶促褐变以及果蔬品质密切相关。

本实验选取蘑菇、茄子、马铃薯为实验材料，提取PPO的粗酶液，再通过考马斯亮兰法法测定蛋白质含量，并采用邻苯二酚、L-多巴为底物，测定PPO活性，最后，进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳。

结果显示，马铃薯酶液中PPO含量最多为15766 μmol·L-1，其次是蘑菇为13931 μmol·L-1，茄子酶液PPO最少，含量为4061μmol·L-1。

但是，以邻苯二酚或多巴为底物时，茄子的比活力最高，蘑菇与马铃薯酶液的比活力相近。

聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，茄子酶液中存在较多同工酶，蘑菇与马铃薯则较少。

关键词多酚氧化酶考马斯亮兰法聚丙烯酰胺凝胶电泳1引言多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO，EC.1.10.3.1)是植物体内普遍存在的一类铜结合酶。

多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。

在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。

在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。

现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。

多酚氧化酶与植物组织培养的酶促褐变以及果蔬品质密切相关。

因此，研究多酚氧化酶（酪氨酸酶）的抑制，对防止水果、蔬菜的褐变，化妆品中的皮肤增白，以及因酪氨酸酶催化产生黑色素引起的疾病（黄褐斑等色素沉着性皮肤病等），具有非常重要的治疗意义。

本实验选取蘑菇、茄子、马铃薯为实验材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。

多酚氧化酶制备与性质多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是存在于多种植物、真菌和动物体内的一种酶类。

它主要参与生物体内多酚类物质的氧化反应，是一种铜酶，催化氧化物质依靠两种配位的单核铜中心。

多酚氧化酶具有高度的催化活性和种类多样的底物适应性，常用于食品产业、医药业和环境污染治理等方面。

多酚氧化酶分离、纯化和制备是开展其相关研究和应用的前提。

其制备方法可分为传统分离、分子生物学技术和重组工程等三种方法。

传统分离方法是采用离心、滤纸剖分、离子交换层析、凝胶过滤层析或超滤等方法，通过化学检测和活性检测手段获得多酚氧化酶。

但这种方法存在着操作麻烦、纯化度低、产率不高等缺点。

分子生物学技术则是利用基因克隆和表达工具，从源头上获得多酚氧化酶基因序列进行提取和纯化。

目前研究中常用的是PCR扩增、应用大肠杆菌或酵母菌实现异源表达等方法。

重组工程方法是指将多酚氧化酶基因定向插入宿主细胞中，结合合理培养条件，利用重组合成技术得到具有高活性和高特异性的多酚氧化酶。

这种方法的优势在于产量高、纯度高且结构相对稳定。

多酚氧化酶性质的主要特点包括多酚类物质的高效氧化反应、菌落变色和储存特性。

多酚类物质的高效氧化反应：多酚氧化酶主要针对多酚类物质进行高效氧化反应。

例如，多酚氧化酶可以催化咖啡因氧化成黑色物质，其颜色变化的过程符合米氏方程（Michaelis-Menten equation），表现出一定的反应速率和反应程度。

菌落变色特性：多酚氧化酶具有天然菌落颜色的变色特性，这是因为多酚氧化酶可以催化多酚类物质氧化成黑色色素，从而产生的颜色变化可以用于分析检测和实验研究。

储存特性：多酚氧化酶可以保存在含钾的磷酸盐缓冲液中，并且可以在冷藏条件下保持其催化活性和稳定性。

但是为了避免酶的降解和变性，一般应该避免恶劣的环境和条件。

综上，多酚氧化酶是一种广泛存在于生物体内的酶类，具有高效催化和底物适应性等优势。

其制备方法包括传统分离、分子生物学技术和重组工程等三种方法。

一、实验目的1. 掌握多酚氧化酶（PPO）的提取方法；2. 了解多酚氧化酶的活性测定原理及操作方法；3. 探讨草莓多酚氧化酶的活性与温度、pH值等因素的关系。

二、实验原理多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的酶，主要存在于植物组织中，参与植物组织的褐变过程。

本实验通过提取草莓中的多酚氧化酶，测定其活性，并探讨其活性与温度、pH值等因素的关系。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜草莓、无水乙醇、蒸馏水、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、硫酸铜、铁氰化钾等。

2. 实验仪器：离心机、分光光度计、恒温水浴锅、研钵、天平等。

四、实验方法1. 多酚氧化酶提取（1）将新鲜草莓洗净，用组织捣碎机捣碎，取适量匀浆；（2）加入适量的无水乙醇，搅拌均匀，室温下放置30分钟；（3）将匀浆转入离心管中，以3000r/min离心10分钟；（4）取上清液，加入适量的硫酸铜和铁氰化钾，室温下放置30分钟；（5）将反应液转入离心管中，以3000r/min离心10分钟；（6）取上清液即为多酚氧化酶提取液。

2. 多酚氧化酶活性测定（1）取一定量的多酚氧化酶提取液，加入适量的磷酸缓冲液（pH值6.8）；（2）将反应液置于分光光度计中，在470nm波长下测定吸光度；（3）以磷酸缓冲液为空白，计算多酚氧化酶活性。

3. 温度对多酚氧化酶活性的影响（1）将多酚氧化酶提取液分别置于不同温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃）的水浴锅中；（2）每5分钟测定一次酶活性，共测定30分钟；（3）比较不同温度下酶活性的变化。

4. pH值对多酚氧化酶活性的影响（1）将多酚氧化酶提取液分别置于不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的磷酸缓冲液中；（2）每5分钟测定一次酶活性，共测定30分钟；（3）比较不同pH值下酶活性的变化。

五、实验结果与分析1. 多酚氧化酶提取通过实验，成功提取了草莓中的多酚氧化酶，提取液呈现蓝色。

2. 多酚氧化酶活性测定通过测定，得到草莓多酚氧化酶的活性为（以每分钟吸光度变化表示）。

多酚氧化酶的制备和性质研究一、实验目的学习从组织细胞中制备酶的方法，掌握多酚氧化酶的作用和化学性质二、原理多酚氧化酶是一种含铜的酶，最适pH为6~7，它催化的氧化还原反应可以通过溶液颜色的变化来鉴定。

它的最适底物是邻苯二酚，间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，也可以被氧化成各种有色的物质。

许多因素都影响酶的催化活性，如温度、pH、底物浓度、酶浓度等。

要测定这些因素对于酶反应的影响，一般是测定不同条件下酶的反应速度。

三、试剂0.01M邻苯二酚溶液柠檬酸缓冲液（pH 4.8，0.05M）饱和硫酸铵溶液四、操作方法（一）酶抽提物制备1、取土豆匀浆液15ml，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混合后4℃放置30分钟2、6000转/分离心20分钟（注意离心前配平），倒掉上清。

3、将沉淀物用约8ml柠檬酸缓冲液溶解，即得到酶粗制品。

（二）多酚氧化酶的作用1、取三支干净的试管编号为1、2、3。

2、按下面要求制备各管管1：加15滴酶抽提液和15滴0.01M邻苯二酚管2：加15滴酶抽提液和15滴水，混合均匀管3：加15滴0.01M的邻苯二酚，15滴水，混合均匀3、将三支试管放于37℃水浴上。

4、每隔5分钟震荡试管并观察每管中溶液颜色的变化并记录。

什么是生物大分子？ 生物大分子:蛋白质、核酸、脂类、糖类。

特点：1.生物活性和在新陈代谢中的作用；2.由简单的结构组合而成生物大分子的制备蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘生物大分子结构与功能生物大分子的制备生物大分子制备的总体思路1、材料的选择和预处理2、细胞的破碎3、提取4、分离纯化5、干燥与保存一、生物大分子制备——生物材料的选择与预处理选择适当的生物材料。

选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。

动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。

1. 了解多酚氧化酶的活性测定原理及方法。

2. 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的操作技术。

3. 通过实验，分析影响多酚氧化酶活性的因素。

二、实验原理多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。

在适宜的条件下，PPO催化酚类物质氧化形成醌类物质，使植物组织发生褐变。

本实验采用分光光度法测定多酚氧化酶活性，以邻苯二酚为底物，通过测定反应过程中吸光度的变化来计算酶活性。

三、实验材料与试剂1. 材料：新鲜马铃薯、0.1mol/L邻苯二酚溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液、NaF溶液、5%三氯乙酸溶液、硫脲、0.01mol/L间苯二酚、蒸馏水。

2. 仪器：分光光度计、匀浆机、离心机、恒温水浴、移液器、试管等。

四、实验步骤1. 酶液的制备：取新鲜马铃薯150g，洗净后切块，加入150mL NaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。

取滤液50mL，于3500r/min离心5-10min，取上清液。

2. 酶活性测定：取3支试管，分别编号为A、B、C。

向A、B、C三管中加入0.1mol/L邻苯二酚溶液1mL、pH6.8磷酸盐缓冲液2mL，向A、B管中加入酶液0.5mL，C管不加。

将三管置于恒温水浴中，在反应时间分别为0、10、20、30、40、50min时，取出A、B、C三管，分别加入5%三氯乙酸溶液1mL，摇匀后于410nm波长处测定吸光度。

3. 数据处理：以邻苯二酚为标准曲线，计算酶活性。

五、结果与分析1. 标准曲线的绘制：以邻苯二酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 酶活性计算：根据标准曲线，计算不同反应时间下的酶活性。

3. 影响酶活性的因素分析：通过实验，分析温度、pH、底物浓度、酶浓度等对酶活性的影响。

1. 成功掌握了分光光度法测定多酚氧化酶活性的原理及操作技术。

2. 通过实验，分析了影响多酚氧化酶活性的因素，为后续研究提供了依据。

七、实验讨论1. 在实验过程中，发现温度对酶活性有显著影响。