牛传染性鼻气管炎的诊断方法
牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Bovine Herpesvirus-1, BHV-1）引起的一种常见的呼吸道传染病，主要感染牛、水牛和羚羊等偶蹄动物。疾病的临床表现主要包括鼻部分泌物增多、打喷嚏、结膜炎、食欲减退、体温升高和呼吸困难等症状。为了及时发现和诊断牛传染性鼻气管炎，需要采用一系列的实验室和临床诊断方法。
一、临床症状观察
临床医生可以通过对患牛的临床症状进行观察，如鼻部分泌物增多、打喷嚏、结膜炎、食欲减退、体温升高和呼吸困难等，进行初步判断是否患有传染性鼻气管炎。这种方法无法确定是否真的感染了IBR病毒，因为上述症状也可能由其他呼吸道感染病原体引起。
二、病原学检测
1. 病毒分离：从临床患牛的鼻部分泌物、眼部分泌物、呼吸道分泌物或流产胎盘等取样，通过细胞培养和PCR等方法，检测是否存在传染性鼻气管炎病毒。
2. 抗原检测：采用ELISA或免疫荧光法检测患牛的血清或分泌物中是否存在传染性鼻气管炎病毒的抗原。
三、血清学检测
通过血清学检测方法，检测患牛的血清中是否存在传染性鼻气管炎病毒的抗体。包括补体结合试验、中和试验、血凝抑制试验和酶联免疫吸附实验等方法。
四、分子生物学检测
采用PCR、RT-PCR或核酸杂交等分子生物学方法，直接检测传染性鼻气管炎病毒的核酸，从而进行诊断。
五、病理学检测
1. 组织病理学检测：通过组织标本的病理学检测，如组织切片、病理组织化学染色等，观察患牛的呼吸道、眼部等组织中是否有传染性鼻气管炎病毒引起的病变。
2. 病理学检测：将患牛的血清用于病理学测试，观察是否存在传染性鼻气管炎病毒的免疫复合物。
牛传染性鼻气管炎的诊断方法
牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是一种病原体为牛传染性鼻气管炎病毒（bovine herpesvirus 1，BHV-1）引起的疾病。牛传染性鼻气管炎主要影响牛的呼吸道，特征性症状包括打喷嚏、鼻流涕、咳嗽和食欲不振等。及时诊断并采取相应的预防和控制措施对于防止疾病的传播和减少经济损失非常关键。以下是牛传染性鼻气管炎的常用诊断方法。
1. 临床症状观察: 根据病牛的临床症状，如打喷嚏、鼻流涕、咳嗽、体温升高和食欲下降等进行观察和判断。
2. 病原学诊断: 进行病原学检测是诊断牛传染性鼻气管炎最常用的方法之一。
- 病毒分离: 从病牛的鼻腔分泌物或病死牛的呼吸道组织中采集标本进行病毒分离。常用的方法包括细胞培养和乳胶凝集试验等。
- PCR检测: 利用聚合酶链反应（PCR）技术，对病牛的鼻腔分泌物、呼吸道组织等样本进行检测，对病毒核酸进行扩增，并通过检测扩增产物的存在来诊断牛传染性鼻气管炎。
- 中和抗体测定: 通过中和反应来检测病牛血清中的中和抗体水平，判断牛是否感染了牛传染性鼻气管炎。
4. 病理学诊断: 对病死牛进行病理解剖，观察病变部位和组织病理学变化，进一步确定是否为牛传染性鼻气管炎。
牛传染性鼻气管炎的病原牛传染性鼻气管炎的诊断和防治-养牛技术
牛的传染性鼻气管炎,是由牛疱疹病毒、鼻病毒引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病,病毒侵入牛体后,导致持续性感染,病牛长期乃至终生带毒,给控制和消灭本病带来极大困难.下面一起来了解一下：牛传染性鼻气管炎的病原牛传染性鼻气管炎的诊断和防治。1、发生和传播病原体为疱疹病毒科的牛疱疹病毒1型。病毒对热敏感，加热至50℃时21 min即死亡。常用消毒药液，如0.5%氢氧化钠溶液、5%福尔马林溶液、1%石炭酸均能在数分钟内将其灭活。该病的主要传染源是病牛及隐性带毒牛。病毒随患牛的鼻液、眼液、阴道分泌物不时排出体外，有的牛康复后带毒时间长达17个月以上。隐性感染牛可在牛群中散布病毒．使该病长期存在，难以根除。易感牛通过吸入污染的空气、飞沫经呼吸道感染。病牛的精液中可带毒，故可通过交配感染，在冷冻保存的精液中，病毒可存活4～12个月。2、临床特征该病的潜伏期为3～7天，有时超过3周。由于病毒重点侵害的脏器不同，表现出不同的临床类型，但通常是不同程度地同时发生，很少单独表现。呼吸道型。为最常见的病型，有时表现为轻微感染，仅见有水样的鼻汁和流泪。也可表现为很严重的疾病。病牛精神沉郁，食欲废绝，体温升高（40℃以上），大量流涎、流泪、流黏液脓样鼻汁。鼻黏膜高度充血，并散在灰黄色粟粒大脓疱性颗粒，以后出现浅溃疡。频发咳嗽，呼吸增数、浅表。生殖器官型。①母牛：该型主要见于性成熟的母牛，母牛患该病型时，以传染性脓疱性外阴道炎为主症。病牛摇摆不安，频频举尾，阴门红肿，流出黏脓性分泌物。阴道黏膜有灰白色粟粒大的脓疱。大量小脓疱形成特征的颗粒状外观。小脓疱相互融合形成广泛的伪膜，脱落后形成浅溃疡，产奶量下降。②公牛：患该病型时以传染性脓疱性包皮一龟头炎为主症。阴茎、包皮水肿，有小脓疱或溃疡，同时多数病牛精囊腺变性、坏死。公牛因此而失去繁殖配种的价值，即使康复也将长期带毒，须坚决予以淘汰。流产型。有的病毒株可以侵害胎盘和胎儿，引起流产，且以头胎怀孕牛多见，流产可发生于妊娠的任何阶段。流产率2%～20%。该病型可与上述两种病型并发，也可能无任何其他症状而突然流产。肠炎型。以2～3周龄的犊牛多见。病犊以呼吸道症状为主，还可导致腹泻症，甚至粪便中带血。犊牛的病死率可达20%～80%。脑膜脑炎型。4～6月龄的犊牛最易发生，病犊在出现上呼吸道症状之后3～5天出现神经症状；共济失调，肌肉震颤甚至倒地、惊厥、抽搐、角弓反张；兴奋和沉郁交替发作，病程大约为5～7天。本型发病率很低（1%～2%)，但病死率很高（50%以上）。角膜结膜型。该型一般与呼吸道型并发。轻症患牛眼睑水肿，结膜充血，大量流泪；重症患牛眼结膜表面形成灰白色伪膜，呈颗粒状外观。重症患牛角膜呈白色混浊，一般无溃疡，流黏液脓样分泌物。3、病理剖检不同临床病型有不同的病理变化。主要病变是重剧的呼吸道黏膜炎症，有浅溃疡，覆盖灰色、恶臭的黏液脓性渗出物。继发细菌感染时，还可见支气管肺炎。生殖道型的变化与临床表现相同。流产胎儿皮肤有水肿和出血，肝、肾和淋巴结有小坏死灶。脑膜脑炎型可见非化脓性脑炎变化。4、诊断要点根据上述临床症状和病理剖检特点，可初诊。最可靠的确诊方法是通过实验室诊断法检测病毒是否存在。用灭菌棉拭子沾取疑似患牛的鼻分泌物、泪液、生殖器官分泌物、公牛精液，以及流产胎儿的胸水、气管、肺、肝、脾等病料后妥善保存，送往有关实验室诊断；或者通过牛传染性鼻气管炎核酸探针技术进行检测。中和试验是最常用的血清学方法，可于急性期和恢复期各采取1份血清送检，中和抗体可持续5年之久。5、防治方案防止传染源传人牛群是预防该病的关键措施。杜绝从已知疫区引牛，确实需要引进牛的，对引进牛须先隔离检疫3周；对种公牛要进行精液检验，确认无病后方可混群，进而参与配种。一经发生该病后，要立即采取隔离措施。国外已生产有弱毒疫苗，除妊娠母牛和种公牛外都可以应用，老疫区只对5～7月龄犊牛接种疫苗。妊娠母牛和种公牛可用灭活疫苗。据报道，免疫期可达3年。康复牛可终生免疫。犊牛吮吸康复牛初乳可获得被动免疫2～4个月。但据报道，使用疫苗并不能阻止持续感染，因此认为捕杀病牛是最有效的控制方法。该病尚无特效药物可供治疗。牛传染性鼻气管炎的病原学牛传染性鼻气管炎（IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）或牛疱疹病毒I型（BHV-Ⅰ）引起，IBRV在分类地位上属疱疹病毒科a疱疹病毒亚科。该病毒呈球形，带囊膜，成熟病毒粒子的直径约150～220nm，主要由核心、衣壳和囊膜三部分组成。核心由双股DNA与蛋白质缠绕而成，包含基因组的核衣壳为立体对称的正二十面体，外观呈六角形，有162个壳粒，周围为一层含脂质的囊膜。双股DNA分子量为8.4x106，其中G+C含量为72%，浮密度为1.731g/cm。IBRV基因组是138Kb的线性双股DNA分子，分成特异长区（UL，106Kb）和短区（US，10Kb），后者被两个反向重复序列（IRS，TRS各为11Kb）包围，因而短区能够反转方向，使病毒DNA具有两种异构体。据测IBRV基因组可编码大约70个蛋白质，其结构和功能目前大部分已知，存在于病毒囊膜的gB、gC、gD和gE四个主要精蛋白基因已经测序并在哺乳动物中表达。gB在哺乳动物细胞中的表达显示出引起细胞融合和多核体的形成，对病毒复制是必需的；gC对病毒吸附组织培养细胞是重要的，但它在牛细胞内的表达并不影响病毒蚀斑的数量和病毒的存在；gD被认为是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子，抗体糖蛋白的单克隆抗体在病毒吸附后中和病毒并显示出较高的中和滴度，表明gD可能参与病毒进入细胞，并为病毒复制非必需基因。鼠和牛的免疫试验显示出gD能够引起比gB、gC更强和持久的细胞免疫。诊断本病的典型病例（上呼吸道炎）具有鼻黏膜充血、脓疱、呼吸困难、鼻腔流脓等特征性症状，结合流行病学，可做出初步诊断，但确诊必须依靠实验室诊断，包括病毒分离鉴定和血清学试验。通常检测血清样品中BHV1抗体的方法有病毒中和试验（VN）和各种酶联免疫吸附试验（ELISA）。另外，还有琼脂扩散试验和间接血凝试验。因为IBRV感染后一般发生病毒潜伏，所以，鉴定血清学中阳性动物是检查动物感染状态非常有用而且理想的指标。抗体阳性动物可认为是病毒携带者和潜在的间歇性排毒者，从初乳获得母源抗体的犊牛和经灭活疫苗免疫的非感染牛除外。（一）病毒中和试验中和试验是以测定病毒的感染力为基础的，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，判定免疫血清中和病毒的能力。它被认为是血清抗体检测最标准的方法。IBRV只有1个血清型，只要有1个已知标准毒株的免疫血清，通过在敏感细胞培养后所进行的中和试验就可以作出鉴定，但该方法存在费时费力、试验周期长、易受不确定因素影响，如病毒毒价的准确性、细胞量的多少及生长情况、病毒/血清孵育时间长短不同等因素将直接影响中和试验的结果，目前在检疫中逐步被酶联免疫吸附试验(ELISA)所替代。（二）ELISAELISA法是将酶与抗原结合成酶标记物，这些酶标记物仍保持原有的免疫学活性和酶的活性，它可与吸附在固相载体上的抗体发生特异性结合，滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体量呈正比，此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定。ELISA法因其具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，在大批量动物进口时作为首选方法被推广使用，但经长期应用发现，目前市场上已商品化的ELISA试剂盒或多或少存在有质量问题，出现假阳性或假阴性的几率较大，很难确保检疫质量，而且进口的试剂盒价格普遍偏高，无形中又增加了检疫的成本。（三）琼脂扩散试验可用已知的IBR抗原检查被检血清中的沉淀抗体，也可用IBR阳性血清来检测病料标本或细胞培养物中的相应抗原。（四）间接血凝试验将已知抗原结合在鞣酸处理的绵羊红细胞上，采用常规的试管凝集法或微量凝集法来检查被检测血清中的相应抗体，这是一种简便、快速、实用的诊断方法。由于IBRV有潜伏感染性，自然感染病牛中和抗体滴度在感染2周时才达到高峰，并且在持续2周或4周后即逐渐下降，且可能降到零，进入潜伏感染期。此后，一旦应激因素刺激，抗体滴度又上升，并排毒，如此反复，IBR感染牛的抗体滴度也随之呈现波浪式的起伏。因此，即便通过中和试验或ELISA法判定牛群IBR抗体呈阴性反应，仍难保证牛群确无IBRV感染。由此可认为，要确定1个牛群是否有IBRV感染的最根本的方法应当是检测IBR抗原。（五）病毒分离鉴定1.样品的收集和处理：从早期感染牛采集鼻腔拭子。对于外阴道炎和**炎病例，采取生殖道拭子，用拭子在生殖道阴道黏膜表面上用力刮取，**可用生理盐水冲洗包皮，收集其洗液。所有样品均应悬浮于运输培养基（含抗生素和2%犊牛血清的组织培养液），储存于4℃，并迅速送达实验室。样品送到实验室后，将拭子在运输培养基中充分搅动以便将病毒洗脱，室温放置30min再取出拭子，将运输液1500r/min离心10min，取上清液用作病毒分离的样品。用做病毒分离的精液需经特殊处理，因为精液中含有对细胞有毒或对病毒增殖有抑制作用的酶和其它因子。2.病毒分离：多种细胞可用于IBRV分离，牛胎儿肺、鼻甲或气管等组织制备的细胞株及已建立的传代细胞系（如MDBK细胞）都比较合适。当使用24孔塑料培养板时，每孔需接种细胞培养物上清液100μl～200μl，吸附1h后倾去液体，然后，加入维持液。每天观察细胞病变情况，一般于接种后3d出现细胞病变现象（CPE）。细胞的典型变化是圆缩，聚集成葡萄样群落，在单层细胞上形成空洞，有时会发现有数个细胞核的巨大细胞。若7d还不出现CPE，应再盲传1次，将培养物经反复冻溶后离心，取其上清液用于接种新的单层细胞做进一步病毒分离。为鉴定致细胞病变的病毒是否为IBRV，细胞培养的上清液必须与单特异IBRV抗血清或单克隆抗体(MAb)作中和试验。（六）免疫荧光试验用来检查眼结膜触片、组织切片和细胞培养物涂片中的IBRV。（七）PCR法1993年，Vilcek将聚合酶链式反应(PCR)方法用于IBR的诊断。试验证明，PCR比病毒分离更加敏感，阳性检出率比病毒分离高出5倍。甚至可检出3个分子的病毒。由于其具有很高的灵敏度而能够在检测牛血清中微量的IBRV等方面得到重要应用。因此，将PCR技术应用到进出境牛的传染性鼻气管炎病毒的检疫，将会大大降低检疫成本和检疫周期，并有效的提高检出率，为打破贸易技术壁垒、促进我国外贸事业的进一步发展，保护我国畜牧业生产的安全发挥出极大的作用。临诊症状自然感染潜伏期一般为4-6天，人工感染(气管内、鼻内、阴道滴注接种)时，潜伏期可缩短至18-72小时，可表现以下临诊类型：(一)鼻气管炎 最常见的症状，有轻有重。病初高热(40-42℃)，精神萎顿，厌食，流泪，流涎，流粘脓性鼻液。母牛乳产量突然下降。鼻粘膜高度充血，呈火红色，并出现浅的、粘膜坏死。呼吸高度困难，呼出气体恶臭，咳嗽不常见。一般经10-14天左右症状消失。(二)传染性脓疱性阴道炎 病初轻度发热，食欲无影响，产奶量无明显改变。动物表现不安，频尿，排尿时因疼痛而尾部高举。外阴和阴道粘膜充血潮红，有时粘膜上面散在有灰黄色、粟粒大的脓疱，阴道内见有多量的粘脓性分泌物。重症病例，阴道粘膜被覆伪膜，并见有溃疡。孕牛一般不发生流产。病程约2周左右。(三)传染性龟头包皮炎 龟头、包皮、阴茎等充血，有时可见阴茎弯曲或形成溃疡等。多数病例见有
・８・ 中国兽药杂志 ２０１３，４７（１２）：８～１２／赵卓，等
牛传染性鼻气管炎病毒的
分离鉴定与灭活疫苗免疫效果研究
赵卓 ，胡义彬 ，潘延钵 ，贺亚奇 ，邓玉芹 ，王力
（１．北京生泰尔生物科技有限公司，北京昌平１０２２０６；２．北京华夏兴洋生物科技有限公司，北京大兴１０２６２９） 【收稿日期］２０１３—０７－０９［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２—１２８０ Ｉ２０１３）１２—０００８—０５【中图分类号］￥８５２．６５３
［摘 要］ 由２例疑似牛传染性鼻气管炎（ＩＢＲ）病例的荷斯坦奶牛分离到一株病毒，命名为 ＩＢＲＶ—Ｃ１株。该病毒可被ＩＢＲ标准阳性血清完全中和；接种ＭＤＢＫ细胞可出现ＩＢＲ病毒典型细胞
病变效应；选取ＩＢＲ病毒ｇＢ蛋白基因序列设计引物进行ＰＣＲ检测和基因测序，结果可扩增出特异 性目的片段；动物回归试验显示，３头牛均可见体温升高、鼻流粘液、呼吸困难等典型的ＩＢＲ临床症
状。在此基础上制备了三批牛传染性鼻气管炎灭活疫苗，并进行了疫苗安全性和效力试验，结果表
明三批疫苗对靶动物安全，免疫效果较好，免疫牛中和抗体效价几何平均值可达１：４１以上，攻毒保 护率达５／５。 ［关键词］ 牛传染性鼻气管炎病毒；分离与鉴定；灭活疫苗；免疫效力
作者简介：赵卓，硕士，兽医师，从事兽用生物制品的研发。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｏｚｈｕｏ２００８＠ｇｍａｉｌ．ｔｏｍ
毒的传播特性、免疫原性、致病性及宿主感染谱等
可能会发生不同程度的变化。国内目前尚未见预
防该病的疫苗研发的相关报道，因此加紧开展禽坦
布苏病毒疫苗的产业化研发，可为控制该病的广泛
流行及养禽业的健康发展提供技术支持。
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