肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体联合长春瑞滨联合干预诱导肺癌A549细胞凋亡及其机制重点

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肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体联合

长春瑞滨联合干预诱导肺癌Ａ５４９细胞

凋亡及其机制

李航王莹张春江赵辉

作者单位：１３００２１长春，吉林省肿瘤医院胸外一科（李航、张春江、赵辉）；１３００００长

春，吉林大学第二医院检验科（王莹）

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－９０３０．２０１６．叭．０３５

【摘要】目的探讨肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（ＴＲＡＩＬ）与长春瑞滨联合诱导肺癌细胞Ａ５４９细胞凋亡可能的分子机制。方法利用噻唑蓝（ＭＴｒ）及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ的方法，研究ＴＲＡＩＬ对

Ａ５４９细胞增殖的抑制，以及其与死亡受体（ＤＲ）４、ＤＩＬ５、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（Ｃａｓｐａｓｅ）－８、Ｃａｓｐａｓｅ－３表达之间的关系。采用流式细胞术检测ＴＲＡＩＬ联合长春瑞滨等肿瘤化疗药物对Ａ５４９细胞凋亡的影响。结果ＴＲＡＩＬ可以明显抑制肿瘤细胞Ａ．５４９的细胞增殖作用，提高Ａ５４９细胞中ＤＲ５、Ｃａｓｐａｓｅ．８、Ｃａｓｐａｓｅ－３的蛋白表达水平，诱导细胞凋亡的发生。长春瑞滨在不同浓度的单药及与ＴＲＡＩＬ联合给药的条件下，诱导的Ａ５４９细胞的凋亡性分别为５．１６００±０．５０２２、１０．２６００±０．４０６３、２０．６１００±１．４０２６；１２．９２００±１．０４０１、１７．７７００±０．８２９８、３７．６７００４－２．０７８７。ＴＲＡＩＬ联合长春瑞滨可以明显促进Ａ５４９细胞的凋亡（Ｐ＜０．０５）。结论ＴＲＡＩＬ通过ＤＲ５、Ｃａｓｐａｓｅ－８、Ｃａｓｐａｓｅ－３信号通路诱导肺癌细胞Ａ５４９发生凋亡。同时，ＴＲＡＩＬ联合长春瑞滨可以明显提高Ａ５４９细胞对药物敏感性，促进细胞凋亡的发生。【关键词】肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体；非小细胞肺癌；长春瑞滨；细胞凋亡基金项目：吉林省卫生厅科研计划资助项目（２０１４ＺＣ０３４）

ＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄａｎｄｎａｖｅｌｂｉｎｅｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒＡ５４９ｃｅＨｓＬ／Ｈａｎｇ，ＷａｎｇＹｉｎｇ，ＺｈａｎｇＣｈｕｎｊｉａｎｇ，Ｚｈａｏ肌ｉＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＴｈｏｒａｃｉｃＳｕｒｇｅｒｙ，ＴｕｍｏｒＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｉｌｉｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＣｈａｎｇｃｈｕｎＪ３ＤＤ２Ｊ，Ｃｈｉｎａ（Ｌｉ日，ＺｈａｎｇＣＪ，Ｚｈａｏ日）；ＤｅｐａｒｔｍｅｍｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｉｌｉｎＵｎｗｅｎｉ＠，ＣｈａｎｇｃｈｕｎＪ３删．Ｃｈｉｎａ（耽，ｌｇｙ）【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅ．１ａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ）ａｎｄＮａｖｅｌｂｉｎｅ（ＮＶＢ）ｔｏｉｎｄｕｃｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＡ５４９．ＭｅｔｈｏｄｓＭｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＭＴＴ）ｗａｓｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆ７ｒＲＡＩＬｔｏＡ５４９ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＴＲＡＩＬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄｅａｔｈｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＤＲ）４，ＤＲ５，Ｃａｓｐａｓｅ一８．Ｃａｓｐａｓｅ一３．ＴｈｅｕｓｉｎｇｆｌｏｗｅｙｔｏｍｅｔｒｙｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆＴＲＡＩＬａｎｄＮＶＢｏｎＡ５４９ｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＪＩＲＡＩＬｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｌｌｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓ．ａｎｄｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅｓｈｏｗｅｄａｐｏｓｉｔｉｖｅｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅｏｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ．ＴＲＡＩＬｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｍｐｒｏｖｅｔ１１ｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣａｓｐａｓｅ一８．Ｃａｓｐａｓｅ一３ａｎｄＤＲ５ｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓ．ａｎｄｉｎｄｕｃｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｃｅｌｌｓ．Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄｃｏｍ—ｂｉｎｅｄｗｉｔｈＴＲＡＩＬａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓｗｅｒｅ５．１６００±０．５０２２．１０．２６００４－０．４０６３，２０．６１００±１．４０２６；１２．９２００４－１．０４０１。１７．７７００４－０．８２９８，３７．６７００４－２．０７８７．７ｒＩ认ＩＬｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＣｈａｎｇｃｈｕｎＲｅｄＳｅａｃｏｕｌｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙｐｒｏｍｏｔｅｔｌｌｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓ．ａｎｄｉｔｈａｄｓｔａｔｉｓｔｉｅａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴＲＡＩＬＣａｎｉｎｄｕｃｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＡ５４９ｖｉａＤＲ５．Ｃａｓｐａｓｅ一８ａｎｄＣａｓｐａｓｅ一３ｔｈｉｓｓｉｇｎａｌｐａｔｈｗａｙ．ＴＲＡＩＬａｌｓｏＣａｎｃｏｍｂｉｎｅｗｉｔｈＮＶＢｔｏｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＡ５４９．ｔｈｕｓｔｏａｃｃｅｌｅｒａｔｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｃｅｌｌｓ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ；Ｎｏｎ—ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｅ—ｅｒ；Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ；ＡｐｏｐｔｏｓｉｓＦｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＪｉｌｉｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＨｅａｌｔｌｌＤｅｐａｒｔｍｅｎｔＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｊｅｃｔ（２０１４ＺＣ０３４）

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（ＴＲＡＩＬ）可以特

异性地诱导肿瘤细胞发生凋亡［¨３。我们利用不同・实验研究・

ＴＲＡＩＬ与长春瑞滨联合探讨肺癌细胞株Ａ５４９增殖和

凋亡效应。

万方数据生堡塞监处型盘！茎！Ｑ！！生！旦笙！！鲞笙！塑垦丛！』垦翌坠垡：』！！！！型！！！！：ｙ尘：！！：丛！：！

资料与方法

１．一般资料：收集吉林省肿瘤医院２０１１年１月至

２０１４年１月收治的既往未接受过化疗、无法进行手术

治疗的晚期非小细胞肺癌患者的相关资料，随访至

２０１４年６月。共人选１７５例，其中男１１０例，女６５例；

中位年龄５８岁；腺癌１２４例，鳞癌４２例，腺癌和鳞癌

混合９例。按照ＴＮＭ分期，Ⅲ期７９例，Ⅳ期９６例。

纳人标准：（１）经肺穿刺、手术活检、纤维支气管镜或

细胞学检查确认为原发性肺癌，病理类型为腺癌、鳞癌

等类型的非小细胞肺癌患者；患者ＴＮＭ分期属Ⅲ～Ⅳ

期。（２）生存时间大于３个月。（３）临床病历资料记

录完整。（４）对本研究知情同意，签署同意书。材料：人肺癌细胞Ａ５４９，用１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ，在含有

５％Ｃ０２、３７℃培养箱中进行培养。ＤＭＥＭ、胎牛血清均购自Ｇｉｂｉｃｏ公司，ＴＲＡＩＬ购自上海歌百德生物技术

有限公司；顺铂购自大连美仑生物技术有限公司；吉西

他滨购自武汉贝尔卡生物医药有限公司；噻唑蓝

（ＭＴＴ）和碘化丙锭（ＰＩ）购自Ｓｉｇｍａ公司；半胱氨酰天

冬氨酸特异性蛋白酶（Ｃａｓｐａｓｅ）一３、Ｃａｓｐａｓｅ．８、甘油醛一３一磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）、死亡受体（ＤＲ）４、ＤＲ５、鼠二

抗、兔二抗购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司。经患者知情同意后。

术后相关组织保存于一８０℃中，用于后续蛋白的提

取。

２．Ｍ１１ｒ１１法检测细胞增殖：将对数期细胞接种于９６

孑Ｌ板中，每孑Ｌ８０００个细胞，待细胞贴壁之后再用不同

浓度的ＴＲＡＩＬ（１０、３０、１００、３００、ｌ０００斗∥Ｌ）处理２４ｈ，每个浓度设５个复孑Ｌ，同时设对照组。２４ｈ之后弃掉

培养液，每孑Ｌ加二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）１５０¨ｌ，避光振荡

５～１０ｒａｉｎ。待沉淀充分溶解后，用酶标仪测４９０ｎｍ吸

光度（４）值。细胞生长抑制率（％）＝［（对照孑Ｌ一实

验孑Ｌ）／对照孑Ｌｌ×１００％。３．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测相关蛋白表达：将处理过的细

胞倒掉培养液之后加入溶菌酶缓冲液（ＥＬＢ）裂解液，

裂解１５ｒａｉｎ左右收集至１．５ｍｌ管中，１２０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心，１５ｒａｉｎ取上清至新的ＥＰ管中，弃沉淀。测

定蛋白浓度，加入加样缓冲液煮样，十二烷基硫酸钠一

聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）分离样品，４℃电转

后用牛奶封闭；加入一抗，４℃过夜；加入相应的二抗，

室温孵育１ｈ，曝光拍照，其中ＧＡＰＤＨ作为内参。

４．聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测相关基因表达：将处

理过的细胞倒掉培养液之后加入总ＲＮＡ提取裂解液

（ＲＺ），之后用试剂盒提取总ｍＲＮＡ，反转录之后检测

相关基冈的表达。

５．ＰＩ染色检测细胞凋亡：取对数期的细胞接种于・１１３・

６孔板，每孑Ｌ接相同数量的细胞，细胞贴壁之后，一组细胞中分别单独加入不同浓度ＴＲＡＩＬ、长春瑞滨、吉他

西滨、顺铂，另一组细胞用ＴＲＡＩＬ和其他药物联合处

理，每孑Ｌ设置３个复孑Ｌ。处理２４ｈ后收集细胞，制成

单细胞悬液，用７０％的乙醇固定后，４℃避光固定

３０ｒａｉｎ。随后，３０００～４０００ｒ／ｍｉｎ离心去上清，重悬

细胞于含１００Ｕ／ｍｌＲＮＡ酶的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）中，

避光３７℃处理３０ｒａｉｎ，加２∥ＬＰＩ至终质量浓度

５０ｍｇ／Ｌ，避光孵育３０ｒａｉｎ，过滤后上流式细胞仪分析。

６．统计学方法：计量数据以均数±标准差（元±Ｓ）

表示，应用ＳＰＳＳ１６．０统计软件分析，多个样本之间的

两两比较采用ｔ检验，以尸＜０．０５为差异有统计学意

义。

结果

１．Ｍ１Ｔｒ检测ＴＲＡＩＬ对人肺癌细胞Ａ５４９细胞增殖

的影响：ＭＴｒ结果表明，ＴＲＡＩＬ在１０～ｌ０００“∥Ｌ的浓度范围内对Ａ５４９细胞具有明显的增殖抑制作用，

并呈现出浓度依赖关系（表１）。

表１不同浓度的ＴＲＡＩＬ处理２４ｈ对Ａ５４９

细胞的抑制性（面±Ｓ）

注：ＴＲＡＩＩ．：肿瘤坏死凶子相关凋亡诱导配体

２．ＴＲＡＩＬ对Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ．８、ＤＲ４和ＤＲ５的表达影响：用不同浓度的ＴＲＡＩＬ处理Ａ５４９细胞２４ｈ

后收集细胞，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ的方法检测Ｃａｓｐａｓｅ一３、

Ｃａｓｐａｓｅ一８、ＤＲ４和ＤＲ５的表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ的结果

表明，以ＧＡＰＤＨ为作为内参，ＴＲＡＩＬ可以提高

Ｃａｓｐａｓｅ一３、Ｃａｓｐａｓｅ．８和ＤＲ５的表达。用短发卡ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）敲低Ａ５４９细胞中ＤＲ５的表达后，用不同浓

度的ＴＲＡＩＬ处理Ａ５４９细胞，检测Ｃａｓｐａｓｅ一８、Ｃａｓｐａｓｅ一３

的表达以及细胞抑制率。结果表明ｓｉ—ＤＲ５之后，

ＴＲＡＩＬ处理Ａ５４９细胞并不能使Ｃａｓｐａｓｅ一８、Ｃａｓｐａｓｅ－３