辐射交联法制备胶原多孔支架材料

《全国辐射技术与辐射改性新材料发展论坛》论文集

106radioprotector. Free Radical.Biol.Med.2000, 28:953.

辐射交联法制备胶原多孔支架材料

张向梅1，2

黄 鑫2

许 零1，2*

陈 欣3

翟茂林4

魏世成1，5*

（1. 北京大学工学院，北京100871

2. 北京大学前沿交叉学科研究院生物医用材料与组织工程研究中心

3. 北京市积水潭医院烧伤整形科，北京100035

4.北京大学化学与分子工程学院，北京100871

5. 北京大学口腔医学院口腔颌面外科, 北京100081）

摘要:采用辐射交联法制备胶原水凝胶,探索制备条件与水凝胶性能之间的关系，研究胶原水凝胶

的机械性能与酶降解性能，通过大鼠体内植入评价其生物相容性。由胶原凝胶进一步制备多孔支架，

在支架上培养成纤维细胞，通过MTT法评价材料的细胞毒性及其促进成纤维细胞增殖的能力。结果

表明辐射交联有效提高了胶原的机械强度和抗酶降解能力，胶原凝胶的生物相容性好，多孔支架可

有效促进成纤维细胞生长。本研究为胶原凝胶作为皮肤支架材料奠定了基础。

关键词：胶原凝胶；辐射交联；生物降解；多孔支架

前言

胶原是细胞外基质的主要成分,在创伤愈合中扮演着重要角色1

。但胶原力学性能较差、降解速

率过快，在实际应用中受到限制，需要通过交联来改善相关性能2

。交联主要分为化学交联法和物理

交联法。常用的化学交联剂有戊二醛（GTA）3

、1-乙基-3（3-二氨基丙基）碳二亚胺和N-羟基丁二

酰亚胺（EDC/NHS）4

、二苯基磷酰叠氮化物（DPPA）5

、环己二异氰酸酯(HMDIC)6

等。这些化学

合成的交联剂具有很高或相对较高的细胞毒性，导致了使用它们进行交联处理的胶原材料存在不同

程度的试剂残留问题。物理交联法有热交联（DHT）7

、重度脱水8

和紫外9

、γ射线10-11

、电子束辐

射12-13

交联等方法，物理交联法可避免外源性有毒化学物质进入胶原内，与化学交联法相比在很大

程度上降低了细胞毒性。因为胶原变性温度低，作为生物材料，其灭菌工艺也受到很大限制。辐照

交联可使交联和灭菌一步完成，避免了后灭菌带来的影响。

胶原是目前国际上几种人工真皮产品的主要成分。已上市的人工皮肤Apligraf®

、Integra®

、

Alloderm®

其主要成分都是胶原。进口真皮支架的价格并不是所有病人都能够承受，尤其是大面积皮

肤缺损的病人。因此，开发一种价格低廉，又能够满足生物学和临床要求的真皮支架产品十分重要。

我们采用辐照交联法制备胶原多孔材料以期作为真皮支架。真皮支架必须具有良好的力学性能

和生物相容性，在移植到创面后应能被机体逐渐降解吸收，与受体真皮组织的再生相协调。因此，

对胶原多孔支架的力学性能、降解和生物相容性的研究十分必要。

1 材料与方法

1.1 辐照实验

胶原与超纯水以一定比例混合均匀后装入玻璃试管，去除气泡并封口。用60

Co-γ射线以20Gy/min

的辐射剂量率辐射不同吸收剂量。

1.2 胶原凝胶机械性能

重大科学研究计划（2007CB936103），北京大学交叉与新兴学科研究基金资助。

* 通讯作者：许零，lingxu@pku.edu.cn；魏世成；sc-wei@pku.edu.cn。 《全国辐射技术与辐射改性新材料发展论坛》论文集

107将圆柱体胶原凝胶(直径约7mm,高约5mm)用Instron5843材料试验机以1mm/min对其进行压缩

测试，用得到的应力-应变曲线初始的直线部分（应变0-0.2）进行线性拟合，直线斜率定为压缩模量。

1.3 体外酶降解

将圆柱体胶原凝胶（直径约7mm,高约10mm）称重后加入新鲜配制的浓度为0.1mg/ml的胶原

酶PBS溶液，放入37℃恒温培养箱，于预定时间取出胶原凝胶停止反应，37℃烘干后称重。按式（1）

计算质量损失率。

1100%=−×

×干胶质量

质量损失率

原湿胶质量固含量 （1）

1.4 体外细胞共培养

将圆柱体胶原凝胶(直径约7mm,高约3mm)冷冻干燥得到胶原多孔支架，待支架被培养基完全浸

润，将生长状态良好的处于对数生长期的成纤维细胞种植在支架上，37℃孵育两天。用MTT法检测

细胞活性。按式（2）计算相对增殖率。

RGR100%=×材料组吸光度

空白组吸光度 （2）

1.5 体内植入

将胶原凝胶移植到大鼠皮下，两周后处死，观察材料降解情况及其与组织的相容性。

2 结果讨论

2.1 辐射交联

用γ射线辐射实现胶原的交联。实验所用胶原浓度及辐照剂量均得到了胶原凝胶，说明胶原发

生了交联反应。实验结果（如图1）表明相同辐照剂量，随体系中胶原含量的增多，交联部分比例

增大。体系中胶原含量相同，随辐照剂量增大，交联部分比例减小。胶原浓度和辐照剂量对交联的

影响很大，提高胶原浓度和减小辐照剂量有利于交联。

图1.辐照剂量与胶原水凝胶质量分数的关系。1-胶原与水的质量比为100/0;2-胶原与水的

质量比为100/100;3-胶原与水的质量比为17/100. 《全国辐射技术与辐射改性新材料发展论坛》论文集

108

2.2 机械强度

胶原凝胶用做人工真皮，其上还要覆盖一层表皮，主要受到压应力。因此对胶原凝胶进行了压

缩测试。不同辐照剂量的胶原凝胶测得的压缩模量稍有差异，总体来说压缩模量随辐照剂量增大呈

上升趋势（如图2）。说明辐照剂量对压缩强度有一定的影响。皮肤的弹性模量测定值范围从0.02MPa

到约100MPa，主要取决于推导材料参数所用的模型和所施加的应力14

。胶原凝胶的压缩模量均在皮

肤弹性模量范围内。若将其用于皮肤组织修复，其机械性能与皮肤匹配。

2.3 体外酶降解

胶原纤维由于广泛的共价交联，其结构稳定，体内有特异作用于胶原的胶原酶(Collagenase)，对

其分解起关键作用。因此要求植入体内的胶原材料具有一定的降解期，研究胶原蛋白的降解特性具

有重要意义。实验表明在0.1 mg/ml胶原酶的PBS溶液中，胶原凝胶质量损失随时间的延长而增加，

而且呈现出一定的辐照剂量相关性（如图3）。在实验条件下，辐照剂量为5kGy的胶原凝胶4h质

量损失率已达到100%，而辐照剂量从10kGy、15kGy、20kGy、25kGy的胶原凝胶4h的质量损失率

分别为94%、74%、54%、37%。随辐照剂量增大，胶原凝胶降解速率减慢，因此，交联提高了胶原

的抗酶降解能力，胶原凝胶的降解速率可通过交联程度控制。

2.4 体外细胞共培养

图3 胶原凝胶的体外酶降解

图2 胶原凝胶的压缩模量 《全国辐射技术与辐射改性新材料发展论坛》论文集

109生物体通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细

胞起着十分重要的作用。在伤口愈合中，成纤维细胞大量增殖。实验结果显示材料组相对于空

白对照组，细胞的相对增值率均大于100%（如图4），说明实验采用的五种辐照剂量制备的胶原支

架均能促进成纤维细胞增殖。由此初步预测胶原多孔支架用作皮肤支架可以促进伤口愈合。

2.5 体内植入

胶原水凝胶植入大鼠皮下，以评价其生物相容性及体内降解速度。两周取材时，实验动物健康

状况良好。埋入处无感染、水肿、积液、坏死等现象。可观察到胶原凝胶保持原有形态，被一层透

明的结缔组织包裹，与机体整合情况良好，显示出良好的生物相容性（如图5）。

3 结论

辐照交联提高了胶原的机械性能和抗酶降解性能，随辐照剂量增大，压缩模量增大，体外酶降

解速率延缓。胶原凝胶植入大鼠体内，组织相容性好，无感染，炎症病变等不良反应。胶原多孔支

架能有效促进成纤维细胞增殖。综上，辐射交联制备的胶原多孔支架有望成为性能优异的人工真皮

替代物。

参考文献：

1 Sai K, P. & Babu, M. Collagen based dressings -- a review. Burns 26, 54-62 (2000).

2 HARA, M. Various cross-linking methods for collagens: merit and demerit of methods by radiation. Journal of Oral Tissue

Engineering 3, 118-124 (2006).

图5 胶原凝胶植入大鼠体内2周后

图4 NIH-3T3细胞在胶原支架上的相对增殖率 《全国辐射技术与辐射改性新材料发展论坛》论文集

1103 Olde Damink, L. et al. Glutaraldehyde as a crosslinking agent for collagen-based biomaterials. Journal of Materials

Science: Materials in Medicine 6, 460-472 (1995).

4 Olde Damink, L. H. H. et al. Cross-linking of dermal sheep collagen using a water-soluble carbodiimide. Biomaterials 17,

765-773 (1996).

5 Petite, H., Frei, V., Huc, A. & Herbage, D. Use of diphenylphosphorylazide for cross-linking collagen-based biomaterials.

Journal of Biomedical Materials Research 28, 159-165 (1994).

6 Vizárová, K. et al. Modification of layered atelocollagen: enzymatic degradation and cytotoxicity evaluation. Biomaterials

16, 1217-1221 (1995).

7 Harley, B. A., Leung, J. H., Silva, E. C. C. M. & Gibson, L. J. Mechanical characterization of collagen-glycosaminoglycan

scaffolds. Acta Biomaterialia 3, 463-474 (2007).

8 曹正国 & 李成章. 常用蛋白交联方法及其对胶原的影响. 国外医学: 生物医学工程分册 24, 187-191 (2001).

9 Lee, J. et al. Characterization of UV-irradiated dense/porous collagen membranes: morphology, enzymatic degradation, and

mechanical properties. Yonsei Medical Journal 42, 172-179 (2001).

10 Ohan, M. & Dunn, M. Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation. Journal of Biomedical Materials