线粒体DNA与细胞癌变关系的研究

■　陕西医学捡验（Ｓｈａａｎｘｉ　ＪＭｅｄ　Ｌａｂ　）第１７卷第１精２∞２　２爿　线粒体ＤＮＡ与细胞癌变关系的研究　陆东东　（南京师范大学生命科学院，江苏南京２１００９７）　中图分类号：Ｑ２４４　Ｑ７５４　Ｒ７３０．２３１　文献标识码　研究表明，卦源性遗传｛匀质如ＤＮＡ病毒或ＲＮＡ病毒　在细胞基因纽中整音能诱导细胞恶性转化　但作为哺乳动　物细胞唯一棱外基因组的线粒俸ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ１，是否也　具有类似于肿瘤病毒那样的活性呢？关于此问题的研究已　从理论上进行了大胆的推阐９，认为线粒体这一最容易受损　伤的细胞器，它所释放的遗传物质有可能具有潜在的致癌　性　但此观点尚缺乏充分的实驻证据　为了探讨ｍｔＤＮＡ与　细胞癌变的关系，本实验采用地高辛（ＤＩＧ）标记的人ｍｔＤ　ＮＡ探针．对６株＾癌细胞系和１例原代培养＾皮肤成纤　维细胞的染色体或问期细胞棱进行了荧光原位杂交　ｃＦＩＳＨ）分析　１材料和方法　１　１　主要试剂ＰＣＲ　ＤＩＧ探针台成皿纯化武剂盒．抗　ＤＩＧ荧光抗体为德国宝灵曼公司产品　鲑精ＤＮＡ、硫酸葡　聚糖、秋水仙碱均为Ｓｉｇｍａ产品。　１　２细胞系　选用４个肺腺癌细胞系即ＳＰＣ—Ａ—ｌ（中国科　学院上海细胞研究所）、ＰＬＡ—Ｒ０１Ｄ（３０ｌ医院）、Ａ　５４９和　Ａ５３１（美国）、１个肝癌细胞系ＳＭＭＣ　７７２１（二军太）　１个　膀胱上皮癌细胞系ＥＪ（美国）、１倒原代培养＾皮肤成纤维　细胞。　１　３　染色悼制备　参照吴秉铨舟绍的方法进行　】．　１　４　ＤＩＧ标记ｍｔＤＮＡ探针的合成、统化噩鉴定用原代　培养人皮肤成纤维细胞的ｍｔＤＮＡ为ＰＣＲ扩增模板，ｍｔｎ＿　ＮＡ提取方法参见文献ｌ２］　ＰＣＲ引物见表１　每个ＰＣＲ扩　增反应体积为５０　，置基因扩增仪（Ｂｉｏ—Ｒａｄ）上．９４。ｃ预　变性５ｒａｉｎ．然后９４。ｃ变性４５　ｓ，５８。Ｃ退火１　ｍｉｎ．讫。Ｃ　延伸２　ｒａｉｎ．３０个循环后于７２℃延伸７　ｒａｉｎ结束。参照　ＰＣＲ产物纯化试剂盒提供的方法进行纯化　ＤＩＧ标记ｍＲ　ＮＡ探针的鉴定参见文献Ｄ】。　表１　ＰＣＲ引糟序列、位点殛扩增片段太小　１　５　ＦＩＳＨ技术　１．５．１　采用路建平舟绍的方法稍加改进。具体过程如下：　染色体经无ＤＮＡ酶的ＲＮＡ酶（１００　Ｆｇ／ｍ］）和蛋白酶Ｋ　（２ＯＯ￣ｇ／ｍ１）消化　２×ＳＳＣ漂洗，酒精等级脱水　在古７０　去离于甲酰胺的２×ＳＳＣ液（７Ｏ　Ｃ）中变性２ｍｉａ．立即放＾　２Ｏ℃的７０　乙醇中剧冷２　ｍｉｎ，再移＾１００　乙醇中脱　水１　ｍｊｎ　取ｍｔＤＮＡ探针各１　ｇ，加人限制酶ＨａｅⅢ（ＧＧ　４　ＣＣ）和ＨｐａⅡ（Ｃ＋ＣＧＧ）各２Ｕ，３７　ｃ水浴酶切２　ｈ；杂交　掖内１　ｎｇ　【ＤＩＧ标记的ｍｔＤＮＡ探针，０　１　ｇ／　鲑精　２５　Ａ文章编号：１００５　１　７１６（２００２）０１　０２５　０２　ＤＮＡ．５０　甲酰胺，ｌＯ　硫酸葡聚糖，２×ＳＳＣ。混匀后于７０　℃水潜变性１０　立且』】置冰上　每张片加５０　Ｉ杂交渍，加　盖玻片ｔ橡皮泥封固一放＾盛有少许２×ｓｓｃ液的湿盒内，　３７　Ｃ孵育２０　ｈ　２×ＳＳＣｌ谴漂洗　１　５．２将抗ＤＩＧ费光抗体ｌｇＧ贮存液（０　２ｍｇ／ｍ］）与１　牛血清白蛋白（４×ＳＳＣ配制）按１：９的比例混音．每个杂　交部位加ｊＯ　抗体工作液．加盖玻片，３７　ｃ避光孵育１　ｈ。　４×ｓｓｃ漂洗，碘化丙啶复染　在荧光显微镜下．以４９０　ｎｍ　的激发光ｔ观察染色体或问期细胞核上的黄绿色信号，每张　片随机记录５００个棱型中有阳性杂交信号的细胞个数，计　算陌性细胞所占的百分比　２结果　２．１　ＰｃＲ　ＤＩＧ标记的ｎｉｔＤＮＡ探针分析结果　ＰｃＲ扩增　产物ｔ在７２６　ｂｐ、８６６　ｂｐ、１５２８　ｂｐ大小相对应的位置上可见　到所需要的核酸探针片段　经纯化后每５０　ＰＣＲ产物可　获得５　ｇ以上探针ｍｔＤＮＡ：　２．２　ＦＩＳＨ结果　３条ｍｔＤＮＡ探针在原代培养＾皮肤成　纤维细胞染色伴或问期棱中均未发现陌性杂交信号；而在　６个癌细胞系的部分染色体或问期细胞桩中均出现了阳性　杂交信号。同一条ｍｔＤＮＡ探针在不同癣细胞系的细胞核　中，阳性所占比例相近；不同ｍｔＤＮＡ探针之间．按每１０００　ｈｐ（１ｋｂ）探针长度在１００个细胞中所出现的阳性细胞数计　算，发生率约为４～５个／ｋｂ．相差不显著（Ｐ＞０　Ｏ５）（表２）。　表２　ｍｔＤＮＡ探针在不同癌细胞中的ＦＩＳＨ分析　

癌细胞系　７２６ｂ戢ｐ　８８６ｂ舭Ｐ　１　５２　／ｋ　ｂ　８ｂ口　（个　）　

ＳＰＣ—Ａ　１　３　３　２　５　８　４　０　Ａ５３１　２　４　２　７　０　４　４　ＳＭＭＣ　７７２１　３　５　２　６　８　５．０　ＰＬＡ一８０１Ｄ　２　ｄ　８　４　４　３　８　Ａ５４９　４　２　２　５　４　３　８　ＥＪ　３．　３　６　７　６　４　８　平均　３．　３　９　６　２　４．３　

３讨论在ＦＩｓＨ分析中，获得足够的高质量ＤＮＡ探针　很关键。一般常用缺口酾译法标记ＤＮＡ探针．但缺口翻译　法标记效率较低，阳性橙出率也比较低。本实验采用ＰＣＲ　扩增Ｄ１Ｇ掺＾法全程标记ｍｔＤＮＡ探针，结果发现其扩增　和标记效率较高　由于ＰＣＲ扩增ＤＩＧ掺＾法合成的探针　为全程标记，其优点在于可　特所得的标记片段用限制酵　切割成尽量小的探针片段　这样在杂交时可增加探针的穿　透力，从而提高杂交信号的阳性检出率　采用ｍｔＤＮＡ探针去检测细胞棱中是否有其同源序列　存在的研究国内外尚未见报道　车研究发现，３条人ｍｔⅡ　ＮＡ探针在原代培养＾皮肤成纤维细胞染色体或间期核中　均未出现阳性杂交信号，而６个癌细胞的部分染色体或间　期棱中均出现ｒ阳性杂交信号　结果表明．癌细胞桩基因组　

作者筒彳ｒ：陆东东，工作单位：江苏省启东肝癌研究所．现　打南京师范大学生命科学院博士生　

维普资讯 http://www.cqvip.com ２６　中存在ｍｔＤＮＡ的同源序列。　关于癌细胞棱基因组中ｍｔＤＮＡ同潦序列的来源问　题．目前尚无定论　但从线拉体的起蔼来看，有更多的依据　支持细胞的内共生学说　因此．细胞核基因组中ｍｔＤＮＡ同　源序列的出现．可能是因ｍｔＤＮＡ片段向细胞棱基园组中　整台造成的。客观上存在ｍｔＤＮＡ厦其片段向棱基因组中　转移井整台的前提条件．如细胞内受损伤线粒体崩解，蝣离　ｍｔＤＮＡ及其片段产生过多；细胞内核酶降解酶活性下降；　棱膜上存在核孔：核内存在核酶降解酶活性下降　核膜上存　在核孔　核内存在ＤＮＡ连接酶等　因此．ｍｔＤＮＡ一旦获得　ｒ游离干线粒体外的机会　它可能会像肿瘤病毒那样一通过　核艟．髓机整舍到棱基因组中。ｍｔＤＮＡ在细胞檀内整音可　能台激活癌基因或抑制抗瘟基因的恬性，使细胞增殖分化　失控，导致细胞癌变ｎ］　车研究发现，同一条ｍｔＤＮＡ探针在不同循细胞系中．　阳性细胞数所占比例相近；不同ｍｔＤＮＡ探针之间．按每　院西医学桂骑（Ｓｈａａｎｘｉ　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｌａｂ　Ｓｃｉ）第１７卷第１期２ＯＯｇ年　Ｊｔ　ｌＯＯＯｂｐ（ｋｂ）探针长度在１００十细胞中所出现的阳性细胞数　计算．发生率为４～５十／ｋｂ．各种探针之问相差不显著　表　明在细胞癌变早期可能发生了过多的线粒体及其ＤＮＡ损　伤，造成了ｍｔＤＮＡ片段在棱基因组中无选掸的随机整　合　］。本研究结果表明，ｍｔＤＮＡ片段在棱基因蛆中整台可　能是诱发细胞癌变的重要原因之一。　参考文献：　［１］胡文德，钱桂生．陈维中．等．一步法快速制备培养细胞线牲　体ＤＮＡ［Ｊ］．中华医学遗传学杂志．１９９７ｉ１４（４）：２５０～２５１　２：　Ｚｕｔｂｓ　ＦＡ　Ｍｉｔｅｃｈｏｎｄｒｉａｔ　Ｄ　ｈａｐ　ｓｅｇｕｅｎｉｅｓ　ａＴ　ｉｎｔｅｇｒａ：ｅｄ　ｉｎ　ｌ１…ｔ　ｎｕｄｅａｒ　Ｅ…ｍｅ—Ｊ］Ｊ　Ｍｏ［Ｂｉｏｌ一１９９１｝２１　１－２）１２０３　

［３］Ｈａｄ［ｅｒ　ＨＩ．Ｄｅｖａｄａｓ　Ｋ—Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ　Ｒ．ｅ　Ｌ　ａｌ　Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｎａｃｌ　ｅ￣ｒ　ＬＩＮＥ　ｅｌｅｍｅ　＿ｓ　ｗｉｔｈ　ｍｉ　Ｌｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｒ）ＮＡ　１ｉｋｅ　ｉｎｓｅ￣ｔｓ　ａｒｅ　…　ｐｔｅｎｔｉ［ｕ【ａｎｄ　ｍｏｂｉｌｅ　ｉｎ　ｔｌｄｍｏ￣ｔｈａｎ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｔｌｓ…ｏｆ　…ｓｅ　ａｎｄ　ｒａ　Ｊ］Ｊ　Ｃｅｌｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｉ　９９ｓ；ｓ８　ｉ　Ｊ　ｉ００　收稿日期：蜘０ｌ　９８　１４　

介绍一种排除支原体液体培养假阳性假阴性的方法　钱纪银，陈廷福　（江苏省扬中市人民医院，江苏扬中２１　２２００）　中图分类号；Ｒ４４６．５文献标识码；Ａ文章编号：１００５　１７１　６（ｇ００２）０１—０２６　０１　支原体是能在无活细胞培养基中繁殖的最小原棱微生　尤其是接舡体表的部分，如男性尿道口－女性的阴道－可有　物．人娄泌屎生殖系支原体群至少包括匕个种．其中人型支　多种细菌．如葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、太肠埃希菌、堂　原体和解腮脲原体被认为是引起某些泌尿生殖系统虞病的　形杆菌等。多种病原微生物可引起生殖系统的感染ｔ细菌有　病因，这类支原体的感染可引起尿道炎、盆腔炎、ｌ弭道炎和　金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、Ｂ一溶血性链球菌、肠球菌、　产褥热，孕妇感染了解脲脲原体和人型支原体后对妊娠会　淋球菌、脑膜炎紊瑟菌、杜克雷嗜血杆菌、不动杆菌、铜绿侣　产生一定的影响．与女性不育、不孕症、习惯性流产　盈男　单胞菌、念球菌、支原体、表原体、螺旋菌及病毒等‘，大多　性不育症也有一定的关系　］。其培养需要较高的营养条件　数葡萄球菌尿素酶、精氨酸双水解醇阻性，有些链球菌能分　但生长速度缓慢，因它们易被其它微生物污染、结果能判断　解精氨酸，部分肠球菌精氮醯双水解醇阳性　－不动杆菌届　仅靠颜色的变化．主观性太强，如ｆｕＩ克服．我们进行ｒ探索．　部分种尿素酶阳性，大多数种精螽酸双水解酶阳性．铜绿假　培养物转种血平板，再转种尿素或精螽酶微量发酵管，能排　单胞菌尿素酶及精氨酸双水解酶阳性一念球菌属尿素酶阳　障部分假阳性及假明性　性等。可见仅按说明书要求．如培养基变红台并混浊结果判　１材料和方涪　定为阴性．可能为假阴性．如菌量少时，液体可不显混浊．但　１　１　试荆　①解脲脲原体披体培养基及＾型支原体培养　转种血平板有生长．如按说明书要求判为阳性．则可能为假　基　。⑦血平板　③尿素和精氨酸微量发酵管。　阳性＝如培养基变红一不管是否台并馄浊．均常规转种血平　１　２　方法按说明书操作，结果阳性，不管上清液是否澄　板，如生长转种尿素发酵管或精舞酸发酵管．能排陈大部分　清．取培养物转种血平板，置３５　Ｃ　５　ｃｏ　培养【８～２＾ｈ　假阳陛或假阴性。　后如长出菌落．解踞腮原体阳性转种尿翥微量发酵管．人型　参考文献　支原体阳性转种精氮酸微量发酵管，井覆盖一层灭菌１暖体　［１］倪语星现代痈原学楂验与’ｌｌｔ沫实践一Ｍ　第１版　海：　石蜡。　上梅科学拄术文献ｔｔｌ版社，１９９９：２１。　２　结果　血平扳培养无菌生长．说明可能支原体阳性，如　［２］曹必午一等泌尿生殖道支原体研究［Ｊ　Ｊ中华睡学拉验杂