全基因组重亚硫酸盐测序【最新版】

甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）第一部分基因组DNA的提取。

这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。

DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。

因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。

否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。

两者均于-20度保存。

验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。

1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。

这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。

PH一定要准确为5.0。

加520ul至上述水浴后溶液中。

6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。

7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。

8：50℃避光水浴16h。

一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am 以后收，时间上很合适。

基因组重测序
基因组重测序（Genome Resequencing）是一种研究族群遗传学和物种进化过程的常用分析方法，它包括对个体或物种基因组的重新测序，以及对基因组的遗传变异的进一步探讨。

基因组重测序可以用来研究物种进化，筛选便利性基因以及鉴定和分析基因组变异。

一、优势
1、基因组重测序的比较优势：重测序比利用芯片进行平面分析方法更加灵活。

能够快速鉴定多种类型的遗传变异，包括插入、缺失、临时变异，以及双倍体变异等。

2、复杂性大：由于重测序可以精细分析基因组中的染色体，因此可以更好地捕捉基因组变异的复杂性。

3、高效性：仪器分析周期短，该技术可以高效地获得基因组芯片和组装基因组变异的信息。

二、应用
1、种群遗传研究：基因组重测序能够针对个体或物种基因组的群体变异和单倍型进行分析，以发现先前未被准确定位的遗传标记和位点，有助于预测物种进入新环境时适应性和抗病性方面的变异。

2、育种研究：基因组重测序可以鉴定出品质和适应性相关的基因和位点，有助于精准育种。

3、公共健康：基因组重测序可以确定某种疾病的发病形态，有助于进
一步深入认识疾病的发生机理以及发病的根源，从而促进公共健康的发展。

三、前景
在未来，基因组重测序技术将会被广泛应用于基因组学中，例如用于进化生物学和疾病基因组学研究，它也可用于转基因技术和育种。

同时也会继续发展新的基因组重测序技术，更新、完善重测序技术，为科学家和科技工作者提供更多先进的应用技术。

全基因组测序从头测序（denovosequencing）重测序（re展开全文全基因组测序全基因组测序分为从头测序(de novo sequencing)和重测序(re-sequencing)。

从头测序(de novo)不需要任何参考基因组信息即可对某个物种的基因组进行测序，利用生物信息学分析方法进行拼接、组装，获得该物种的基因组序列图谱，从而推进该物种的后续研究。

基因组重测序是对有参考基因组物种的不同个体进行的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。

基因组重测序主要用于辅助研究者发现单核苷酸多态性位点(SNPs)、拷贝数变异(CNV)、插入/缺失(Indel)等变异类型，以较低的价格将单个参考基因组信息扩增为生物群体的遗传特征。

全基因组重测序在人类疾病和动植物育种研究中广泛应用。

技术路线生物信息分析案例解析1.比较基因组分析采用progressiveMauve软件比对9株大肠杆菌O104:H4分离株的染色体序列，展示可移动遗传元件和基因组可变区域信息，利用核心SNP位点信息构建最大似然进化树揭示菌株间的亲缘关系。

2.重复序列分析采用从头预测和基于数据库比对的两种方法对纳塔尔大白蚁和湿木白蚁的基因组序列进行转座子(TEs)分析，利用RepeatModeler软件对两种方法的结果进行整合分析并构建转座子序列数据库，使用RepeatClassifier软件对转座子进行分类，计算两种白蚁基因组中转座子的序列变异速率，揭示基因组扩张的可能机制。

3.代谢通路重建根据限制性脱氯细菌(PER-K23)基因组注释信息，预测类咕啉的生物合成包含4种代谢途径。

4.基因进化分析利用117个单拷贝编码蛋白的基因序列构建Mollicutes、Haloplasma和Firmicutes菌株的最大似然物种进化树，揭示不同菌株基因组中mreB和fib基因的获得与丢失。

测序策略及数据量测序策略：PE125或PE150建议数据量：根据基因组大小进行30×或50×的测序。

全基因组重测序数据分析1。

简介(Introduction）通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排突变（deletioin，duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA)，重组率(Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。

我们将在基因组学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。

实验设计与样本(1）Case—Control 对照组设计；（2）家庭成员组设计：父母—子女组（4人、3人组或多人）；初级数据分析1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。

2．一致性序列组装:与参考基因组序列（Reference genome sequence)的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。

3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。

并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。

4．InDel检测及在基因组的分布：在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel.在检测过程中，gap的长度为1～5个碱基.对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired—End序列的支持。

5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。

第一章测试1.被誉为“生物信息学之父”的科学家是（）.A:吴瑞B:林华安C:DulbeccoD:Sanger答案:B2.没有直接参与完成人类基因组计划的国家是（）。

A:中国B:德国C:英国D:俄罗斯答案:D3.人类基因组计划要完成的几张图谱分别是（）A:序列图谱B:物理图谱C:遗传图谱D:生物图谱E:基因图谱答案:ABCE4.生物信息学主要研究的两种信息载体是（）A:转录因子B:启动子C:氨基酸序列D:核酸序列E:转座子答案:CD5.分子生物学与细胞生物学领域以DNA-RNA-蛋白质为对象，分析编码区和非编码区中信息结构和编码特征,以及相应的信息调节与表达规律。

（）A:错B:对答案:B第二章测试1.DDBJ的含义是（）。

A:欧洲分子生物学实验室B:美国国家生物信息中心C:日本DNA数据库D:中国基因组研究中心答案:C2.如果我们试图做蛋白质亚细胞定位分析，应使用（）。

A:PDB数据库B:NDB数据库C:GenBank数据库D:SWISS-PROT 数据厍答案:D3.（）是现在国际上最主要的三大核酸序列数据库A:EBIB:NCBIC:DDBJD:EMBLE:GenBank答案:CDE4.生物学数据库存放数据类型有哪些？（）A:序列特征B:三维结构C:序列D:文献E:基因组图谱答案:ABCDE5.KEGG数据库是一个综合数据库，整合了基因组、化学和系统功能信息，并建立了跨物种间的联系。

（）A:对B:错答案:A第三章测试1.假设你有两条远源相关蛋白质序列。

为了比较它们，最好使用下列哪个BLOSUM和PAM矩阵（）A:BLOSUM45和PAM1B:BLOSUM45和PAM250C:BLOSUM80和PAM250D:BLOSUM10和PAM1答案:B2.要在数据库查询一段与某DNA序列编码蛋白质最相似的序列，应选择（）A:tblastnB:blastnC:tblastpD:blastpE:blastx答案:E3.最常用的序列相似性查询工具是（）A:BLASTB:PIRC:PDBD:FASTAE:SWISS-PROT答案:AD4.多序列比对的工具有哪些（）A:MAFFT工具B:MultAlinC:T-coffeeD:ClustalWE:ClustalX答案:ABCDE5.所谓局部比对是找出两个被比较序列的最类似片段。

全基因组重测序数据分析1. 简介(Introduction)通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。

我们将在基因组学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。

实验设计与样本（1）Case-Control 对照组设计；（2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）；初级数据分析1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。

2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。

3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。

并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。

4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。

在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。

对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。

5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。

全基因组重测序基础及高级分析知识汇总借着2月8号，刚刚在Nature上发表柑橘的遗传进化的文章，小编来讲述一下全基因组重测序基础知识，以及常见的分析思路及软件，帮助大家迅速入门。

全基因组重测序是通过对已有参考序列（Reference Sequence）的物种的不同个体进行基因组测序，并以此为基础进行个体或群体水平的遗传差异性分析。

通过全基因组重测序，研究者可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP）、拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）、插入缺失（InDel，Insertion/Deletion）、结构变异（Structure Variation，SV）等变异位点。

基于以上变异位点作为分子遗传标记，在人类复杂疾病、动植物经济性状和育种研究及物种起源、驯化、群体历史动态等方面具有重大的指导意义(Bentley2006; Casillas& Barbadilla 2017)。

一、基础理论知识全基因组重测序研究主要是依据在全基因组水平发现的分子遗传标记进行物种的群体遗传学研究，进一步的利用统计方法进行影响表型和经济性状候选基因和功能突变的研究。

分子群体遗传学研究的理论基础知识及统计分析方法日趋完善和呈现多样性，作为初学者，有必要对其中的一些基础概念有一定的了解，才能为后续的深入学习、研究提供基石。

以下基础知识主要参考国内动物遗传学书籍和最新的一篇关于分子群体遗传学方面的综述改变而成(吴仲贤编1961; 李宁2011; 吴常信2015; Casillas & Barbadilla 2017)。

高通量测序技术作为分子群体遗传学研究的有力工具，在科学研究、生产及疾病诊断治疗中起到原来越重要的作用，对关于高通量测序相关的理论基础知识进行一定程度的了解，也有助于文献阅读和。

1. 群体遗传学基础知识群体（Polulation）：是指生活在一定空间范围内，能够相互交配并生育具有正常生殖能力后代的同种个体群。

全基因组测序流程
1 全基因组测序
全基因组测序的全称为Whole Genome Sequencing（WGS），是一
种通过分析基因组中每一条核酸序列，来研究物种及其相关基因的技术。

WGS技术可以揭示产生个体的全部遗传信息，对理解复杂疾病、遗传研究、肿瘤细胞分离等有重要意义。

2 WGS流程
WGS流程由四大步骤：基因组制备、测序生成、数据分析、解析准备。

1）基因组制备：在做全基因组测序之前，需要首先准备新鲜收集
的细胞样本、微生物或动物组织样本，过程中常使用DNA抽提技术和
微流技术进行处理，以获得样品中的有效DNA。

2）测序生成：将经过DNA抽提的样本，或捐赠的自然样本，都会
经过一定的过程进行萃取后，分别进入测序和组装。

除了采用Sanger
测序和pyro sequencing等常规技术外，近年来，产生测序技术出现
较大进展，基本上都采用了massive parallel sequencing（MPS）技术，可以获取数以百万计的序列数据，节省了大量的时间和费用。

3）数据分析：这一步需要将生成的原始序列比对到参考基因组中，以及将低质量的序列移除，通常会采用bioinformatics、Python、R
等计算工具进行分析。

4）解析准备：最后可以解析样本的基因组，发现影响疾病遗传机制及基因变异的差异，以作进一步的分析。

3 总结
全基因组测序是一种研究物种及其相关基因的技术，它需要经历四步技术。

第一步要生成可用于测序的有效DNA；第二步要采用MPS技术，生成数量庞大的序列数据；第三步采用计算工具进行数据分析；最后进行解析准备，发现潜在的基因变异进而对其进行分析。

广东省人民防空办公室2018年人防工程防护设备定点生产和安1广东省人民防空办公室2018年人防工程防护设备定点生产和安装企业监督管理“双随机一公开”抽查实施方案根据《广东省人民防空办公室“双随机一公开”监管工作基本方案》要求，制定本方案。

一、抽查事项清单二、建立抽查对象和执法人员名录库（一）抽查对象名录库按照动态调整的要求，以抽签前一天人防工程防护设备定点生产和安装企业实际目录清单，建立抽查对象名录库。

（二）执法人员名录库以省人防办工程处具有行政执法证书的人员建立执法人员名录库。

三、确定抽查对象和执法人员（一）确定抽查对象根据《广东省人民防空办公室“双随机一公开”监管工作基本方案》要求，按照5%的抽取比例，从人防工程防护设备定点生产和安装企业抽查对象名录库中随机抽取抽查对象。

省人防办和市人防（民防）办开展“双随机一公开”抽查工作，确定的抽查对象为同一家企业时，应按照程序重新在名录库中随机抽取调整，避免重复抽查。

（二）确定执法人员从执法人员名录库中随机选派执法人员2人。

四、抽查专家组在市人防办、检测机构、质监站邀请4名专家组成专家组，参与抽查，提供技术支持。

五、抽查规则（一）过程留痕对随机抽签和执法行为过程中容易引发争议的关键环节通过文字记录，实现过程留痕和可追溯管理。

（二）内部监督随机确定抽查对象和执法人员，党办监察室和法规宣传处对随机抽取过程全程监督记录。

（三）过程执法执法人员对确定的检查事项和内容，按流程开展检查。

发现涉嫌违法的依法查处，涉嫌犯罪的，依法移送相关部门处理。

六、抽查工作流程（一）确定抽查时间抽查对象和执法人员名单、抽查事项和内容确定后，记录存档，并予以公示。

通知抽查对象，明确具体抽查时间。

（二）抽查准备1.明确职责分工。

执法人员负责具体执法抽查，法规宣传处负责执法结果合法性审核，秘书人事处负责后勤保障。

2.强调工作纪律。

明确工作程序和工作纪律，强调公平公正执法，依法执法，不违法、不越权、不以权谋私，对被抽取的市场主体实施检查时，不得妨碍市场主体正常的生产经营活动，不得索取或收受市场主体的财物，不得谋取其他利益。