新生小鼠耳蜗血管纹边缘细胞的原代培养及鉴定

实验三、小鼠解剖及动物原代细胞培养

引言：细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外 模拟体内的生理环境， 使离体的细胞在体外生长和繁殖， 并且维持其结构和功能 的一种培养技术。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 从供体获得组织细 胞，在无菌条件下， 用胰蛋白酶消化或机械分散等方法， 将动物组织分散成单个 细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。 当培养的动物细胞 生长增殖达到一定密度， 形成致密的单层细胞时， 用胰蛋白酶将细胞消化分散成 单细胞，从一个容器中以 1：2 或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法， 称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

细胞培养的意义 :具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控 制，便于单因子分析； 便于人们直接对细胞内结构、 细胞生长及发育等过程的观 察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤 学及病毒学等）已被广泛应用。

细胞培养的局限性： 在脱离机体复杂环境下， 细胞培养条件与躯体环境有一 定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物 少。

培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最 适PH、营养条件和培养基质等。

1.实验材料 ：

实验室购买的雄性小鼠、 13.5 天孕鼠。

DMEM培养基（胎牛血清、青/链霉素溶液）、胰蛋白酶溶液、PBS溶液（NaCI 8.00g,

Na2HP04 1.15g，KCl 0.20g，KH 2P04 0.20g，pH 调至 7.2，超纯水定容到 1000mL， 分装，121 C灭菌20 min）

2. 实验步骤 ：

2.1 处死小鼠

用右手拇指和食指捏住雄性小鼠或怀孕雌鼠尾巴中部放在铁笼上, 使小鼠前 肢接触铁笼（后肢悬空） ,左手从小鼠后方向前按住鼠头及颈部。左手拇指、食 指用力向下按压鼠头及颈部, 同时右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方, 造成颈椎 脱臼，造成小鼠立即死亡。 当小鼠停止抽搐，松开左手。将整个小鼠浸入盛有 75% 乙醇的烧杯中。

听力学及言语疾病杂志２ＯＯ７年第１５卷第４期　３０３　ＫＣＮＱ　１在小鼠耳蜗血管纹的表达　及在听觉中的意义＊　褚汉启　熊浩　韩芳　吴振恭　周良强　黄孝文　崔永华　・实验研究・　

【摘要】　目的探讨ＫＣＮＱ１在耳蜗侧壁血管纹的表达及其在听觉中的作用。方法　以不同基因型小鼠Ｋｃ－　ＮＱ１　一（突变纯合子）、ＫＣＮＱ１　一（杂合子）和ＫＣＮＱ１　（野生型）以及Ｃ５７ＢＵ６Ｊ小鼠为实验对象，采用免疫组织化　学和ＡＢＲ检测技术，检测ＫＣＮＱ１在小鼠耳蜗血管纹的表达及其听力。结果ＫＣＮＱ１蛋白阳性颗粒集中在小鼠耳　蜗血管纹边缘细胞顶膜。ＫＣＮＱ１“　小鼠的听力正常，短声ＡＢＲ的阈值为３６．６７±７．１３　ｄＢ　ＳＰＬ；ＫＣＮＱ１　一小鼠听力　低于同窝ＫＣＮＱ１　野生型鼠，短声ＡＢＲ的阈值为３　８＿２５±９．３５　ｄＢ　ＳＰＬ；ＫＣＮＱ１　一小鼠呈现全聋，ＡＢＲ在１００　ｄＢ　ＳＰＬ时仍无反应。结论ＫＣＮＱ１是位于耳蜗侧壁血管纹边缘细胞的重要通道蛋白，在维系耳蜗听觉功能中有重要　作用。ＫＣＮＱ１通道蛋白的缺失或功能受限可以不同程度地影响耳蜗的听觉功能。　【关键词】ＫＣＮＱ１；离子通道；耳蜗；听力　【中图分类号】Ｒ３３９．１６　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１００６—７２９９（２００７）０４—０３０３一ｏ４　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＫＣＮＱ１　ｉｎ　Ｓｔｄａ　Ｖａｓｃｕｌａｒｉｓ　ｏｆ　Ｍｏｕｓｅ　Ｃｏｃｈｌｅａ　ａｎｄ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＫＣＮＱＩ　ｏｎ　Ａｕｄｉｔｏｒｙ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　Ｃｈｕ　Ｈａｎｑｉ，Ｘｉｏｎｇ　Ｈａｏ，Ｈａｎ　Ｆａｎｇ，ｅｔ　ａ１．　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，Ｔｏｎｇｊｉ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｎｇｊｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ，４３００３０，Ｃｈｉｎａ）　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｉｅｃｔ￣Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆＫＣＮＱ１　ｉｎ　ｓｔｒｉａ　ｖａｓｃｄａｒｉｓ　ｏｆｍｏｕｓｅ　ｃｏｃｈｌｅａ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆＫＣＮＱＩ　ｉｎ　ａｕｄｉｔｏｒｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｔｒｘｌｓ　Ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｉｎ　Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｈｅａｔｉｎｇ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＫＣＮＱ１　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｉｃｅ，ｈｅｔｅｍｚｙｇｏｕｓ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ　ｍｉｃｅ　ｕｓｉｎｇ　ａｕｄｉｔｏｒｙ　ｂｒａｉｎｓｔｅｍ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＡＢＲ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅ－　ｓｕＩｔｓ　ＫＣＮＱ１　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗａｓ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｔｅｒａｌ　ｗａｌｌ　ｏｆ　ｍａｒｇｉｎａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｓｔｒｉａ　ｖａｓｅｕｌａｒｉｓ．Ｔｈｅ　ａｕｄｉｔｏｒｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＫＣ－　ＮＱ１　“ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｎｏｒｍａ１．Ｔｈｅ　ｍｅａｎ　ＡＢＲ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｃｌｉｃｋ　ｓｏｕｎｄ　ｓｔｉｍｕｌｕｓ　Ｗａｓ　３６．６７±７．１３　ｄＢ　ＳＰＬ　ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｖａｌｕｅｉｎＫＣＮＱ１　ｍｉｃｅｗａｓ　３８．２５　４－９．３５　ｄＢＳＰＬ．Ｉｎ　ｒａｌａｔｉｏｎｔｏｔｈａｔ　ｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎＫＣＮＱ１　“ｍｉｃｅ．ＫＣＮＱ１一　一ｍｉｃｅｗｅｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ　ｄｅａｆ．Ｎｏ　ＡＢＲ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｔ　ｅｖｅｎ　１００　ｄＢ　ＳＰＬ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＫＣＮＱＩ　ｉｓ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｓｔｒｉａ　ｖａｓｅｕｌａｒｉｓ　ｏｆ　ｃｏｃｈｌｅａ　ａｎｄ　ｐｌａｙｓ　ａ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｃｏｃｈｌｅａｒ　ａｕｄｉｔ０ｒｙ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆＫＣＮＱ１　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＣＯ－　ｃｈｌｅａｒ　ｓｔｒｉａ　ｖａｓｃｕｌａｒｉｓ　ｍａｙ　ｂｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ叭ｄｉｔ０ｒｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ＫＣＮＱ１；Ｉｏｎ　ｃｈａｎｎｅｌ；Ｃｏｃｈｌｅａ；Ａｕｄｉｔｏｒｙ　由ＫＣＮＱ１基因编码的ＫＣＮＱ１通道（又称Ｋｖｌｑｔｌ　通道）属于电压依赖性门控钾通道蛋白，ＫＣＮＱ１蛋　白可分布于人体上皮组织和非上皮组织，包括心脏、　内耳、胰腺、肾脏及消化器官…。研究发现分布于耳　蜗的ＫＣＮＱ１通道可能在内耳钾离子代谢中具有重　要作用　。Ｊ。本实验对同窝生的ＫＣＮＱ１　野生型　鼠、ＫＣＮＱ１　一杂合子鼠和ＫＣＮＱ１　一突变纯合子鼠，　＊　国家自然科学基金资助项目（编号３０６７２３９７）　１华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉科华中科技　大学同济医学院耳鼻咽喉科学研究所（武汉４３００３０）　作者简介：褚汉启，男，山东人，医学博士，教授，从事听觉生理和内耳　病理研究。　通讯作者：褚汉启（Ｅｎｍｉｌ：ｃｈｕｈｑ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ）　采用听性脑干反应（ａｕｄｉｔｏｒｙ　ｂｒａｉｎｓｔｅｍ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＡＢＲ）　检测其听力，并应用免疫组化实验观察ＫＣＮＱ１蛋白　在Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠耳蜗中的表达，旨在初步了解ＫＣ．　ＮＱ１通道蛋白在小鼠耳蜗组织中的表达及其在听觉　功能中的作用。　１材料与方法　１．１实验动物来源及鉴定ＫＣＮＱ１基因杂合子和　突变纯合子小鼠由美国Ｊａｃｋｓ加实验室引进，按照孟　德尔遗传原则，以亲代ＫＣＮＱ１“一杂合子（ｈｅｔｅｒｏｚｙ．　ｇｏｕｓ）ｄ￣鼠雌雄配对，在本实验室自行培育出第二代　小鼠，采用第二代的ＫＣＮＱ１　小鼠（野生型，ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）５只、ＫＣＮＱ１　一杂合子小鼠６只和ＫＣＮＱ１　一　突变性纯合子（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ｍｕｔ

Ｊｂｕｍａｌ　ｏｆＡｕｄｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｓｐｅｅｃｈ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　２０Ｏ７．Ｖｏｌ　１５．Ｎｏ．２　豳　豚鼠耳蜗血管纹边缘细胞钾离子通道特性的研究＊　

吴婷婷　孔维佳　姚琦　李隽　郭长凯　李之望　【摘要】　目的研究单个豚鼠耳蜗血管纹边缘细胞的基本电生理特性。方法应用耳蜗血管纹组织块培养　技术和全细胞膜片钳技术，观察单个培养的豚鼠血管纹边缘细胞在电压钳模式下的电流特性。结果边缘细胞上　记录到钾离子电流，该钾通道有以下特性：①具有电压依赖性；②通道的活动可被４一氨基吡啶（４一ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，４　一ＡＰ）和四乙铵（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｎｍ￣ｎｉｕｍ，ＴＥＡ）在相对高浓度下阻滞；③细胞外钙离子浓度的减少可导致该钾通道电流的　降低。结论豚鼠耳蜗血管纹边缘细胞钾离子通道电流包括钙离子依赖性钾电流、外向延迟整流钾电流和Ａ型钾　电流。　【关键词】血管纹；边缘细胞；钾通道；膜片钳　【中圈分类号】Ｂ３３９．１６　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１００６—７２９９（２００ｒ７）０２—０１２６—０４　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｐｅｒｔｙ　ｏｆ　Ｐａｔａｓｓｉｕｍ　Ｃｈａｎｎｅｌ　ｉｎ　Ｍａｒｇｉｎａｌ　Ｃｅｌｌ　ｏｆ　Ｓｔｒｉａ　Ｖａｓｃｕｌａｒｉｓ　ｏｆ　Ｇｕｉｎｅａ　Ｐｉｇ　Ｃｏｃｈｌｅａ　Ｗｕ　Ｔｉｎｇｔｉｎｇ，Ｋｏｎｇ　Ｗｅｉｊｉａ，Ｙａｏ　Ｑｉ，ｅｔ　ａ１．　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ　Ｕｎｉｏｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｎｇｊｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ，４３００２２，Ｃｈｉｎａ）　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔ￣Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｍｐｅｘｔｉｅｓ　ｏｆｔｈｅ　ｐａｔａｓｓｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌｉｎｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｍａｓ￣ｉｎａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｓｔｒｉａ　ｖａｓｃｕｌａｒｉｓ　ｏｆ　ｓｕｉｎ￣ｐｉｇ　ｃｏｃｈｌｅａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｏｆｃｏｃｈｌｅａｒ　ｍａｒｇｉｎａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆｓｕｉｎ￣ｐｉｇｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌｌ　ｐａｔｃｈ—ｃｌａｍｐ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｕｒｒｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ｍａｒｇｉｎａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｓｔｒｉａ　ｖａｓｃｕｌａｒｉｓ　ｏｆ　ｓｕｉｎ￣ｐｉｇ　ｃｏｃｈｌｅａ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆｔｈｅ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｗｅｒｅ　ｉｎｄｅｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｗａｓ　ｖｏｌｔａｇｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｂｌｏｃｋｅｄ　ｂｙ４．二ＡＰ，ＴＥＡ　ｉｎ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｈｉ　Ｓｈ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄｔｈｅ　ｃｕｒｒｅｎｔｓ　ｏｆｔｈｉｓ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ｃａｌｃｉｕｍ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｕｒｒｅｎｔ．Ｃｏｆｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｕｒｒｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐ￣ｅｄ　ｏｆｃａｌｃｉｕｍ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｕｒｒｅｎｔ．ｏｕｔｗａｒｄ　ｄｅｌａｙｅｄ　ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ａｎｄ　Ａ　ｔｙｐｅ　ｃｕｒｒｅｎｔ．　【脚ｗｏｒｄｓ】Ｓｔｒｉａ　ｖａｓｅｕｌａｒｉｓ；Ｍａｒｇｉｎａｌ　ｃｅｌｌ；Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ；Ｐａｔｃｈ　ｃｌａｍｐ　正常耳蜗内淋巴微环境对毛细胞的机械一电转　导起着重要的作用。耳蜗内淋巴液作为一种细胞外　液是相当独特的，它具有类似于细胞内液的离子成　分，即Ｋ　浓度高，Ｎａ　、ｃ　浓度低，而外淋巴液中　Ｋ　浓度低，Ｎａ　、Ｃ　浓度高，并且内淋巴还有相对　于外淋巴＋８０　ｍＶ’一＋９０　ｍＶ的耳蜗内电位（ｅｎｄｏｃｏ．　ｃｈｌｅａｒ　ＤＣ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＥＰ）ｕ　ｊ。耳蜗Ｃｏｒｔｉ器外侧依次　是：ｃｌａｕｄｉｕｓ细胞（ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｃｌａｕｄｉｕｓ）、外沟细胞（ｏｕｔｅｒ　ｓｕｌｃｕｓ　ｃｅｌｌｓ）、螺旋突细胞（ｓｐｉｒａｌ　ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ　ｃｅｌｌｓ）和血　管纹边缘细胞（ｍａｒｇｉｎａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒｉａ　ｖａｓｃｕｌａｒｉｓ）。　血管纹是构成膜性蜗管外壁的重要组成部分，它是　

新生小鼠小脑颗粒神经元的原代培养与鉴定

方晨昊;刘辉庆;夏泽阳;高俜娉;鲍南

【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》

【年(卷),期】2024(33)1

【摘 要】目的通过改进已报道的新生小鼠小脑颗粒神经元培养方法,以获得纯度更高,杂质更少,状态更佳的颗粒神经元。方法将小鼠小脑组织剪碎,经木瓜蛋白酶消化后得到单细胞悬液,采用Percoll非连续性密度梯度离心法分离出颗粒神经元前体细胞,种植在基质胶包被过的培养皿中并在培养20 h后给予阿糖胞苷(5μmol/L)处理8h。使用激光共聚焦显微镜及神经元特异性标志物微管相关蛋白2(MAP2)对小脑颗粒神经元细胞进行纯度鉴定。结果细胞存活率达98.03%±1.048%;神经元纯度为99.71%±0.2%。结论该方法获取的颗粒神经元存活率和纯度较高,是一种小鼠小脑颗粒神经元体外培养的可靠方法。

【总页数】6页(P56-60)

【作 者】方晨昊;刘辉庆;夏泽阳;高俜娉;鲍南

【作者单位】上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心神经外科

【正文语种】中 文

【中图分类】R365

【相关文献】

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