烟碱受体在非洲爪蟾卵母细胞的表达及特征(C-1994)
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11
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帽,1994May;s(2)
:l一。
一l一3
烟碱受体在非洲爪蟾卵母
细胞的表达及特征
陈厚昌’oergePHE
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(
Seet
ion
ofBioe
he
misr
即Mo
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Corne
llUniversi
妙Ne。YOrk14
853)
摘要分别
给非
洲爪蟾印毋细
胞微量注封电
瑶电器
官烟
减型胆
碱受体(
NZ
一ChR)
和大鼠
脑烟
碱型
胆碱
受体(Nz一
ChR)
的mR
NA
表
达出相应的
N一ChR
采用全细
胞和部分细
胞灌流法测定
不同浓
度氛甲
醚胆
碱引起的NZ
一ChR
产生的
膜电
流以
最小
反应
模型方
程拟合两法
所得
量反应
曲线非常
接近KI
值
分别为
0528
和04
91mmolLI;
小l
值分另J为
3861
和
3891
采用全细
胞灌流法测得不同浓
度氛甲酞胆碱引
起的
表达Nl一
ChR
产生的
膜电
流拟合所得的
量反应
曲线较
之相
应的NZ
一ChR
曲线明显左移
药和。l
值
分另J为
014
0mm
olL1
和3125
关
键词
有爪蟾
蛤;
卵母细
胞;
受体胆
碱能;
塞因
表
达;
动力学
非洲爪
蟾卵母细胞(Xeno
尸us
laevlsooeyt
e)
已被
广泛应
用于表达各种受体蛋白和离
子通道蛋白〔’〕
为
研究受体与离子通道的特
性和亚基组成等提供
了重要
手段然
而由于卵母细胞体积大(
直径约为1
mm)
以通常的全细胞
灌流
方法给
药最
先与
药物接
触产生反应的受体与最后者之间的时间差距很大象
烟碱型胆
碱受
体(
nieotinieacety
leholinereeep
tor
N
一chR)
这
样一些快速脱敏的受体〔’
〕
对分析
受体
的
特征是否会有影响
本文企图用
部分细胞灌流法给
药以
尽量缩短给药表面各
部分接触药物的时间差
距来测定卵
母细胞表达的电鳃(To
rPedo)电器官
NZ
一ChR
的某些化学动力学特
性并与全细胞灌流法
者进行
比较以评价两种方法之间的差异
现以证明
大
鼠脑Nl一
ChR
的
结构组成特异性激
动剂和拮
抗剂
等与NZ
一chR
有明显的差异
以‘〕但很少见有关两
种
受
体动力学
特性的
比较
本文企图通过测定卵母细胞
表达的Nl
一和NZ一ChR
的某些化学动力学参数进行比
较为阐明两种不同亚型的N一ChR
的
特征提供点滴
实验依据
材料与方法
非洲爪
蟾购自Ann
Arb
。:
公司;RN
A
体外转录
1993一01一11收稿
1993一08一14
现在第
一军医大学药理教研室接受
厂州5105
15试剂盒二鸟葺三磷酸(
GPPPG)
和重蒸
酚均为
P
romeg
a
公司产品;
氯仿(
色谱
纯)
和无水
乙醇为
Fisher
公司产
品;
寡聚脱氧胸普纤维素为Boehring
er
Mannh
eim
公司产
品;
其余试剂均
为Sigma
公司产品
所有
用于mR
NA
实验的玻璃器
皿均经250℃
烤6
h
以上非玻璃器皿和
用于配制溶液
的水均
以01
%焦
碳酸二乙醋(
diethy
一py
roearbonatenEP
C)
处理6
h
以上而后高压灭菌
电
鳃NZ
一ch
R
的mRNA
的制
备参
考文献
〔56
〕方法并将转
录反应时
间由lh
改
为Zh
聚
合
酶由一次加人改为分2
次加人(即先加人一
半反应
l
h
后再加入另一半)分别
以含电鳃NZ一ChR
四种亚
基(:
刀下
占)全长eDNA
的p
SP64T
为模板通
过体外转录合成mR
NA
获得的mRN
A
溶解于01
molL
’Kel
溶液中配成约059
L,
置一50℃
冰
冻保存备
用
大鼠
脑N
厂chR
的mRNA
制
备根据改良
silv
erm
an
〔7
〕
法将
已转化
了该受体的二;和刀:
正基
cDN
A(
分别重组
人酵母表达载体pMA
C561
和
YEP351
中)
的
酵母TD;(
已证明此酵母能转录功能
性。;
和
刀:
亚基mR
NA
及翻译出:;
和刀:
亚基蛋白
待另文发表)
接种于含002%尿啼咤和
0002%组氨
酸的SD(
syn
th
etiedextr
ose)
培养液中30
℃培养
至A6
0nm=
住6一08
离
心收集
沉淀
以
原体积1
/5
的DEPC
处理水洗涤沉淀2
次沉淀置一80
℃冻结30
mln
加原体积l/100
的RNA
提
取液(
015
mol
L1N
aCIs
mmolLIE
nTA5
%5
05somm
ol
L’Trisp
H75)和等体积酚
一氯仿混合液混合后置
室温smm
加人约1
/3
体积的直径045
尽m
坡璃
珠振荡混合4
min
离心收集水相再以
酚氯仿混
合液反
复抽
提2
一3
次
乙醇沉淀RN
ARNA
以
寡
聚脱氧胸普纤维
素亲和层
析法〔8
〕
分离得p
oly(
A)
RNA
后者溶解于01molL
’KCI
溶液中配成约
1
59L
’
供注射
用
卵
母细胞的制
备及注
射参考文献
〔9
〕的方法
制备卵母细胞每个细胞注射2
0
一50nL
的mR
NA
溶
液对
照组注射等量的01molL
’KCI
注射后的卵
母细胞置于含509L
’
链霉素1
0kuL
’
青霉
素06%马血清25mmolL’
丙
酮酸钠的B
盯th
溶
液
中置16
一18
℃培养3
一10d
每天换液一次