烟碱受体在非洲爪蟾卵母细胞的表达及特征(C-1994)

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l

帽,1994May;s(2)

:l一。

一l一3

烟碱受体在非洲爪蟾卵母

细胞的表达及特征

陈厚昌’oergePHE

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(

Seet

ion

ofBioe

he

misr

即Mo

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iol口gJ

Corne

llUniversi

妙Ne。YOrk14

853)

摘要分别

给非

洲爪蟾印毋细

胞微量注封电

瑶电器

官烟

减型胆

碱受体(

NZ

一ChR)

和大鼠

脑烟

碱型

胆碱

受体(Nz一

ChR)

的mR

NA

达出相应的

N一ChR

采用全细

胞和部分细

胞灌流法测定

不同浓

度氛甲

醚胆

碱引起的NZ

一ChR

产生的

膜电

流以

最小

反应

模型方

程拟合两法

所得

量反应

曲线非常

接近KI

分别为

0528

和04

91mmolLI;

小l

值分另J为

3861

3891

采用全细

胞灌流法测得不同浓

度氛甲酞胆碱引

起的

表达Nl一

ChR

产生的

膜电

流拟合所得的

量反应

曲线较

之相

应的NZ

一ChR

曲线明显左移

药和。l

分另J为

014

0mm

olL1

和3125

键词

有爪蟾

蛤;

卵母细

胞;

受体胆

碱能;

塞因

达;

动力学

非洲爪

蟾卵母细胞(Xeno

尸us

laevlsooeyt

e)

已被

广泛应

用于表达各种受体蛋白和离

子通道蛋白〔’〕

研究受体与离子通道的特

性和亚基组成等提供

了重要

手段然

而由于卵母细胞体积大(

直径约为1

mm)

以通常的全细胞

灌流

方法给

药最

先与

药物接

触产生反应的受体与最后者之间的时间差距很大象

烟碱型胆

碱受

体(

nieotinieacety

leholinereeep

tor

N

一chR)

样一些快速脱敏的受体〔’

对分析

受体

特征是否会有影响

本文企图用

部分细胞灌流法给

药以

尽量缩短给药表面各

部分接触药物的时间差

距来测定卵

母细胞表达的电鳃(To

rPedo)电器官

NZ

一ChR

的某些化学动力学特

性并与全细胞灌流法

者进行

比较以评价两种方法之间的差异

现以证明

鼠脑Nl一

ChR

结构组成特异性激

动剂和拮

抗剂

等与NZ

一chR

有明显的差异

以‘〕但很少见有关两

体动力学

特性的

比较

本文企图通过测定卵母细胞

表达的Nl

一和NZ一ChR

的某些化学动力学参数进行比

较为阐明两种不同亚型的N一ChR

特征提供点滴

实验依据

材料与方法

非洲爪

蟾购自Ann

Arb

。:

公司;RN

A

体外转录

1993一01一11收稿

1993一08一14

现在第

一军医大学药理教研室接受

厂州5105

15试剂盒二鸟葺三磷酸(

GPPPG)

和重蒸

酚均为

P

romeg

a

公司产品;

氯仿(

色谱

纯)

和无水

乙醇为

Fisher

公司产

品;

寡聚脱氧胸普纤维素为Boehring

er

Mannh

eim

公司产

品;

其余试剂均

为Sigma

公司产品

所有

用于mR

NA

实验的玻璃器

皿均经250℃

烤6

h

以上非玻璃器皿和

用于配制溶液

的水均

以01

%焦

碳酸二乙醋(

diethy

一py

roearbonatenEP

C)

处理6

h

以上而后高压灭菌

鳃NZ

一ch

R

的mRNA

的制

备参

考文献

〔56

〕方法并将转

录反应时

间由lh

为Zh

酶由一次加人改为分2

次加人(即先加人一

半反应

l

h

后再加入另一半)分别

以含电鳃NZ一ChR

四种亚

基(:

刀下

占)全长eDNA

的p

SP64T

为模板通

过体外转录合成mR

NA

获得的mRN

A

溶解于01

molL

’Kel

溶液中配成约059

L,

置一50℃

冻保存备

大鼠

脑N

厂chR

的mRNA

备根据改良

silv

erm

an

〔7

法将

已转化

了该受体的二;和刀:

正基

cDN

A(

分别重组

人酵母表达载体pMA

C561

YEP351

中)

酵母TD;(

已证明此酵母能转录功能

性。;

刀:

亚基mR

NA

及翻译出:;

和刀:

亚基蛋白

待另文发表)

接种于含002%尿啼咤和

0002%组氨

酸的SD(

syn

th

etiedextr

ose)

培养液中30

℃培养

至A6

0nm=

住6一08

心收集

沉淀

原体积1

/5

的DEPC

处理水洗涤沉淀2

次沉淀置一80

℃冻结30

mln

加原体积l/100

的RNA

取液(

015

mol

L1N

aCIs

mmolLIE

nTA5

%5

05somm

ol

L’Trisp

H75)和等体积酚

一氯仿混合液混合后置

室温smm

加人约1

/3

体积的直径045

尽m

坡璃

珠振荡混合4

min

离心收集水相再以

酚氯仿混

合液反

复抽

提2

一3

乙醇沉淀RN

ARNA

聚脱氧胸普纤维

素亲和层

析法〔8

分离得p

oly(

A)

RNA

后者溶解于01molL

’KCI

溶液中配成约

1

59L

供注射

母细胞的制

备及注

射参考文献

〔9

〕的方法

制备卵母细胞每个细胞注射2

0

一50nL

的mR

NA

液对

照组注射等量的01molL

’KCI

注射后的卵

母细胞置于含509L

链霉素1

0kuL

青霉

素06%马血清25mmolL’

酮酸钠的B

盯th

中置16

一18

℃培养3

一10d

每天换液一次