脂质体包埋反义Toll样受体4质粒对内毒素刺激小鼠的作用

臌质体包煺反义Ｔｏｌｌ样受体４质控埘内毒索刺激小鼠瓣墨塑

脂质体瞧埋殷义ＴｏｌＩ样受体４质粒对内毒素刺激小鼠的影响

背罱和目的：枣交接簧

内毒索血瘢是由革兰氏阴性菌释放或裂解出的细胞脂多糖

（１ｉｐｏｐｏ｜ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）成份一一内海素所致。在肝虢疾病、重症胰

腺炎、烧伤、感染等情况下常豢伴发内毒素血瘰。严蓬危及人镪躲健康恳

无有效的治疗手段。

近年来，随着Ｔｏｌｌ家族的发现，尤其是Ｔ０１ｌ样受体４（ＴＬＲ４）的发

现，内毒豢致病熬分子瓤铡纛在被逐爹鬻朔。ＴＬＲ４在与肉毒素络台瑶，

形成复合体进行信号转导，激活ＮＦ．ｘＢ等转黎因子，诱导细胞熙予如肿

癌繇惩霞予．ｇ（彳ＮＦ－ａ）、自细胞介豢．１等过量裘达。增强了宿主对内毒索

的免疫反成，但也给桃体带求了严霾的负性效应，导致宿主发热、出盘、

低血压、休克、弥漫性血管内凝血（ＤＩＣ）、多脏器功能衰竭（ＭＯＦ），甚

至死亡。

本疆懿在分子生耪举静笈震芨添寐静逵切需要豹簇穑上，剥粥反义技

术构建反义ＴＬＲ４表达质粒，转染入小鼠体内来对内毒素刺激小鼠进行派

疗。躐溺其楚否辩低奎簸ＴＬＲ４ｍＲＮＡ的水平以及减少内毒豢的毒性作用，

以此探讨ＴＬＲ４焱内毒豢血症中的僚号转黟作赐及其浚疗弱徐僵。

糖辩秘方法：

一、建立夏义ＴＬＲ４表这覆粒

裰摇小鬣ＴＬＲ４ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ序弩ＡＦ０９５３５３）设计ＴＬＲ４特异瞧

Ｂｌ物，上游５’端带上ＥｃｏＲｌ酶切经点，下游５’端袋上鼬ｎ

ｌ傻点。以

小鼠细胞ＲＡＷ２６４．７抽提的总ＲＮＡ为ＲＴ－ＰＣＲ模板，扩增ＴＬＲ４片段。用

Ｔ４ＤＮＡ连接酶爨ＴＬＲ４产物连接裂ｐＧＥＭ－Ｔ载薅上，形癌ｐＧＥＭ－ＴＬＲ４

质粒，然后转染ＪＭｌ０９感受态细胞。在含氨苄肖霉素的ＬＢ琼脂平板上筛

选鼯瞧壳爨，辍黩尧隆矮粒逡簿扩灌察捷提。酶切ｐＧＥＭ．ＴＬＲ４戳及载体

ｐＴｔｒａｃｅｒ－ＣＭＶ２，纯化各自目的片段。由于在ｐＴｔｒａｅｅｒ－ＣＭＶ２载体，上的凝

．２．骀质体包埋反义Ｔｏｇ样蹙体４质箍对内毒豢剿鞋鱼塞墼受塑

启动子的序列中Ｋｐｎｌ位于ＥｃｏＲＩ蛇上游，按照碱基配对原则粘性采端相

弱豹诱溺荔予连接，掰戳逶遘ＤＮＡ连接爱寂藐镬ｐＧＥＭ—ＴＬＲ４矮簸瓣ｌ

酶切产物反向连接到ｐＴｔｒａｃｅｒ－ＣＭＶ２载体上，形成ｐＴｔｒａｃｅｒ－ＣＭＶ２反义

ＴＬＲ４麟粒。

二、反交ＴＬＲ４矮粒与空自旗粒转染枣飘Ｃ５７／ＢＬ

用脂质体ＤＯＴＡＰ包埋ｐＴｔｒａｃｅｒ－ＣＭＶ２反义ＴＬＲ４质粒积ｐＴｔｒａｃｅｒ－

ＣＭＶ２黧鑫霹爨蠹羧（１００Ｐ．ＩＤＯＴＡＰ／１５０１／．ｇＤＮＡ矮粒）。当馕稳瓣与蟹蕤戆券渡

ＤＭＥＭ在无菌环境中混合放置３０分钟后，以尾静脉给药的方式给予实验

组脂质体反义Ｔｏｌｌ液达质粒２ｍｉ，对照组空白质粒２ｍｌ，空白组生理盐水

２ｍｌ，隧三天强佬，多莓强健两次宠成转染过稷。透过荧巍显激襞硷溅璇粒

掰携带鹪绿色荧光蛋自（ｇｒｅｅｎ

ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）报告蘩斑的

表达，剡断转染是磷成功。

三、及义瓢盈霹矮粒霹建毒豢蒯激零簸熬影响

在实验室条件下用内毒素刺激小鼠Ｃ５７／ＢＬ，观察３缎小鼠的生物学行

为改变。用ＲＴ—ＰＣＲ梭溅小鼠组织中ＴＬＲ４ｍＲＮＡ的变化，论证反义ＴＬＲ４

瘦粒戆黉洚低体蠹ＴＬＲ４ｍＲＮＡ敬表这。ＴＬＲ４ＲＴ－ＰＣＲ莓｜携分蘩为：生游

Ｓ’哦Ｃｇ悠ＣＡｌ℃ＧＧ引舔筒ＫＴＴＧ一３’，下游Ｓ’—Ａ］鸭ＧＣＡＣＣ甜广Ｔ毯ＡＡＧａ－ＧＡＧ一３’。

通过ＥＵＳＡ法检测胖瘸坏死因予，ａ浓度的变化，论证反义ＴＬＲ４质ｊ畿熊否

降低体内细胞因子过凝分泌。从而对反义基阙疗法在内赫黎血症的治疗的

价值传秘步的评徐。

结聚。

形成的ｐＴｔｒａｃｅｒ—ＣＭＶ２反义ＴＬＲ４质粒缀过ＤＮＡ测廖诞实ＴＬＲ４部分

序列凑骥蜷反囱连接到ｐＴｔｒａｃｅｒ－ＣＭＶ２载体童，谈骧ｐＴｔｒａｃｅｒ－ＣＭＶ２反

义ＴＬＲ４覆粒已戒功构建。

用脂质体分别包煅ｐＴｔｒａｅｅｒ—ＣＭＶ２反义ＴＬＲ４质粒和空白质粒臌，转

染入小懿体内，通过棱测质粒上携带的绿色荧光蛋白证嶷履粒己转染夺疑

维缀串。

通过对转染不周质粒小鼠用内毒素刺激后，观察其生物学反应的麓异，

证实反义ＴＬＲ４质粒对减轻内毒豢的毒性作用是有效的。

藉雳ＲＴ－ＰＣＲ熬方法迁实反义ＴＬＲ４霞荻麓簿羝组缀内ＴＬＲ４ｍＲＮＡ麓

表达，说明反义ＴＬＲ４质粒发挥了其抑制靶溅躐的效果。朦质体包域艇义删样受体４质挫对内毒素刺激小鼠的影响

嚣ＬＩＳＡ法测定，ｊ、鬣斑清静癌薛毵蠢予堪浓发，证实瓣瘩涿死爨子一ａ浓

度降低，说明反义ＴＬＲ４质粒对由内毒素舡症引起的细胞因子的过量分泌

寿撵铡终焉。

小结

ＴＬＲ４蹩痰毒素藉号转导翡关键健受钵。奉轿究逶过复爻基蠢按寒梅建

ｐＴｔｒａｃｅｒ－ＣＭＶ２及义ＴＬＲ４质粒并且用脂质体包埋后转染入小鼠体内。

ｐＴｔｒａｃｅｒ－ＣＭＶ２反义ＴＬＲ４质粮可以降低经内毒索刺激小鼠的毒性反

应，抑制组织内ＴＬＲ４

ｍＲＮＡ的表达，以及减少缨腿鼹子的分泌。这为我

们治疗内毒素盘瘫提供了一种有前途的方法。

美键词

志毒素；ＴＬＲ４；滕矮薅；爱义矮粒；纲庭毯子；詹号转嚣；转粢臻鹱俸包蠼反义Ｔｏｌｌ榉受体４囊粒对斑毒素耧激小疑豹影响

Ｉｍｐａｃｔｏｆ

ｌｉｐｏｓｏｍｅｗｉｔｈａｎｔｉｓｅｎｓｅＴｏｌｌ－ｌｉｋｅ

ｒｅｃｅｐｔｏｒ４

ｐｌａｓｍｉｄｏｎ

ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｍｉｃｅ

Ｂａｅｋｇｒｏｕｎｄａｎｄａｉｍ：Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａｉｓ

ａｓｅｒｉｏｕｓｃｌｉｎｉｃａｌ

ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｗｈｉｃｈｉｓｃａｕｓｅｄ

ｂｙ

ｒｅｌｅａｓｅｏｆ

Ｇｒａｍ—ｎｅｇａｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）．ｉｎｌｉｖｅｒ

ｄｉｓｅａｓｅ，

ｎｅｃｒｏｔｉｃ

ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，ｂｕｒｎ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ

ｓｏｏｎ，ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａｉｓｃｏｍｍｏｎ．Ａｔ

ｐｒｅｓｅｎｔ，ｉｔｈａｓ

ｎｏｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ．

Ｗｉｔｈ

ｔｈｅ

ｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆ

Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ

ｒｅｃｅｐｔｏｒｆａｍｉｌｙ，ｅｓｐｅｃｉａｌＴｏｌｌ—・ｌｉｋｅ

ｆｅｃｅｐｔｏｒ４．ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ

ｉｓｓｈｏｗｅｄ

ｃｌｅａｒ

ｎＯＷ．ＡｆｔｅｒＴＬＲ４ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈ

ＬＰＳ，ＴＬＲ４

ｓｉｇｎａｌｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘｉｓｆｏｒｍｅｄａｎｄ

ｔｈｅ

ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ

ｂｅｇｉｎ．Ａｓａｒｅｓｕｌｔ，ａｌＯｔｏｆ

ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｓｕｃｈ

ａｓ

ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ

ｋａｐｐａＢ（ＮＦ－Ｋ嚣）ａｒｅ

ａｃｔｉｖａｔｅｄ，ｗｈｉｃｈｉｎｄｕｃｅ

ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｏｆ

ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ

ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｕｍｏｒ

ｎｅｃｒｏｓｉｓ

ｆａｃｔｏｒ—ａｌｐｈａ（ＴＮＦ・ａ），ｉｎｔｅｒｌｕｋｉｎ—Ｉ（ＩＬ・１），

ｉｎｔｅｒｌｕｋｉｎ－６（ＩＬ－６）ｅｒｅ，Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｉｔ

ｅｎｈａｎｃｅｈｏｓｔ’Ｓｉｍｍｕｎｅ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ａｔ

ｓａｍｅｔｉｍｅ

ｉｔａｌｓｏ

ｂｒｉｎｇｓａｂｏｕｔ

ｎｅｇａｔｉｖｅ

ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｆｅｖｅｒ，ｂｌｅｅｄｉｎｇ，

ｈｙｐｏｔｅｓｉｏｎ，ｓｈｏｃｋ，ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ

ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ（ＤＩＣ），ｍｕｌｔｉｐｌｅ

ｏｒｇａｎｆｕｎｃｔｉｏｎｆａｉｌｕｒｅ（ＭＯＦ），ｅｖｅｎｄｅａｔｈ．

Ｂｅｃａｕｓｅｏｆｔｈｅ

ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆ

ｍｏｌｅｃｕｌａｒ

ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ

ｅｍｅｒｇｅｎｔｎｅｅｄｏｆ

ｃｌｉｎｉｃａｌ

ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｗｅｕｓｅｄ

ａｎｔｉｓｅｎｓｅ

ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｔｏ

ｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｎｔｉｓｅｎｓｅ

ＴＬＲ４

ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｐｌａｓｍｉｄ，ａｎｄｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄｅｄｉｔｉｎｔｏｍｉｃｅ

ｔｈｒｏｕｇｈｌｉｐｏｓｏｍｅ（ＤＯＴＡＰ）

ＳＯａｓｔｏｏｂｓｅｒｖｅｗｈｅｔｈｅｒ

ａｎｔｉｓｅｎｓｅＴＬＲ４

ｃａｎｄｅｃｒｅａｓｅ

ｍＲＮＡ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｏｆ

ＴＬＲ４ｉｎｅｎｄｏｔｏｘｉｎ・ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ

ｍｉｃｅａｎｄ

ｒｅｄｕｃｅｔｏｘｉｃ

ｅｆｆｅｃｔｏｆ

ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．

Ｈｅｎｃｅｗｅ

ｃｏｕｌｄ

ｅｘｐｌｏｒｅ

ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆＴＬＲ４

ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｎ

ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ

ａｎｄ

ｐｏｓｓｉｂｌｅｖａｌｕｅｏｆ

ｇｅｎｅ

ｔｈｅｒａｐｙ．

Ｍｅｔｈｏｄｓ：

１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｏｆ

ａｎｔｉｓｅｎｓｅ—－ＴＬＲ４－－ｐｌａｓｍｉｄ

．５．艚质体包攫反义Ｔｏｌｌ样受体４质粒对内毒豢朝璇夺黧豹影唪ｌ

Ｗｅ

ｄｅｓｉｇｎｅｄａｐａｉｒｏｆ

ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓａｔｔａｃｈｉｎｇｔｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ

ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｓｏｍｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ

ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｅＤＮＡ

ｓｅｑｕｅｎｃｅ

ｏｆｍｏｕｓｅＴＬＲ４（Ｇｅｎｅｂａｎｋ

ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＡＦ０９５３５３）．Ｕｐｓｔｒｅａｍ

ｐｒｉｍｅｒ５７

ｔｅｒｍｉｎａｌｃｏｎｔａｉｎｓ

ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＥｃｏＲｌ

ａｎｄｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ

ｐｒｉｍｅｒ５７

ｃｏｎｔａｉｎｓｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ

ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ

ＫｐｎＩ。ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆｍｏｕｓｅｃｅｌｌｌｉｎｅ

ＲＡＷ２６４．７

ｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｉｔｓ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｓ

ｕｓｅｄ

ａｓｔｅｍｐｌａｔｅｆｏｒ

ｒｅｖｅｒｓｅ

ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＰＣＲ）．Ｔｈｅ

ｐｒｏｄｕｃｔｏｆＲＴ－ＰＣＲｉｓ

ｓｕｂｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏ

ｐＧＥＭ－Ｔ

ｖｅｃｔｏｒ

ｔｈｒｏｕｇｈＴ４

ｅｎｚｙｍｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｇｐｌａｓｍｉｄｉｓ

ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏ

ｈｉｇｈｃｏｍｐｅｔｅｎｔｅｅｌｌＪＭｔ０９．Ｔｈｅ

ｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌＣａｎ

ｂｅｓｅｌｅｃｔｅｄｉｎ

Ｌｕｒｉａ・Ｂｅｒｔａｎｉｍｅｄｉｕｍ

ａｇａｒｏｓｅｐｌａｔｅｓ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｍｐｉｃｉｌｌｉｎａｎｄ

ｗｅ

ａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｅｘｔｒａｃｔｅｄｔｈｅｓｅｓｅｌｅｃｔｅｄｃｏｌｏｎｉｅｓ．Ａｆｔｅｒ口ＧＥＭ．Ｔｏｌｌ

４ａｎｄ

ｐＴｔｒａｃｅｒ—ＣＭＶ２

ｖｅｃｔｏｒｗａｓ

ｄｉｇｅｓｔｅｄａｎｄ

ｐｕｒｉｆｉｅｄ，ＴＬＲ４ｃａｌｌｂｅ

ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ

ｉｎｔｏｔｈｅＥｃｃｎｑＺ

ａｎｄ

ＫｐｎＩ

ｅｎｚｙｍｏｌｙｔｉｃｓｉｔｅｏｆ

ｐＴｔｒａｃｅｒ—ＣＭＶ２ｉｎａｎｔｉｓｅｎｓｅ

ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｂｅｃａｕｓｅｏｆ

ｓｔｉｃｋｙｅｎｄａｃｔｉｏｎｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ

ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｂｙ

ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｂａｓｅ

ｐａｉｒ．ＴｈｅｐＴｔｒａｃｅｒ・ＣＭＶ２＊ａｎｔｉｓｅｎｓｅ—ＴＬＲ４

ｐｌａｓｍｉｄｉＳｔｈｅｒｅｆｏｒｅ

ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．

２。ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｐＴｔｒａｃｅｒ－ＣＭＶ２－ａｎｔｉｓｅｎｓｅ・ＴＬＲ４

ｐｌａｓｍｉｄａｎｄ

ｐＴｔｒａｃｅｒ－

ＣＭＶ２

ｐｌａｓｍｉｄｉｎｔｏＣ５７／ＢＬ

ＬｉｐｏｓｏｍｅｗｉｔｈｐＴｔｒａｃｅｒ－ＣＭＶ２－ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＴＬＲ４