第二十章_细胞工程

第二十章 细胞工程 掌握细胞工程的有关概念、原理和技术以及应用。生物工程，遗传工程，细胞工程 微生物工程，酶工程，蛋白质工程，生物化学工程，细胞工程，植物细胞工程， 动物细胞工程，干细胞技术，目前我国细胞工程研究简况 一、植物细胞工程 植物细胞培养 原生质体培养 原生质体融合 染色体工程 植物细胞遗传工程 （一）Plant Cell Culture 植物细胞培养的应用 获得再生植株 消除病害 种质的长期贮藏 合成次生代谢产物 （二）原生质体培养 固体培养法 液体培养法 （三）原生质体融合 (四）染色体工程 多倍体育种 单倍体育种 染色体显微操作技术 染色体转移技术 （五）植物细胞遗传工程 分离和制备特定的基因；将目的基因与载体连接； 将重组的DNA引入受体细胞，使之复制、转录和表达，从而获得所要求的生物制品或生物体。 植物转基因方法 农杆菌介导法（Agrobacterrium-mediated transformation） 基因枪转化法（Microprojectile bombardment） ，又称微弹射击法 聚乙二醇介导法（PEG-mediated transformation） 脂质体转化（Liposomes transformation） 花粉管通道法（Pollen-tube pathway） 电激法（Electroporation） 显微注射法（Electroporation） 激光微束转化法（Laser microbeam puncture） 二、动物细胞工程 细胞培养 细胞融合 胚胎工程 转基因技术 细胞拆合 克隆技术 干细胞技术 （一）Animal Cell Culture （二）杂交瘤技术与单克隆抗体 (三) 胚胎工程（embryo technology）发育工程（developmental technology） 胚胎培养 胚胎移植 单性生殖 嵌合体(chimera) 1.胚胎培养 体外受精 不同时期胚胎的体外发育潜能 一定的合成培养液 要求一定的气相条件 2.胚胎移植 提高良种母畜的繁殖力 动物性别控制 节约精液 保存遗传资源 保护濒危动物 试管婴儿 试管动物 3.单性生殖 雌核发育 雄核发育 同卵多胎 体细胞核移植 4. 嵌合体 （四）转基因技术 转基因动物制作过程 基因的克隆、重组技术 外源基因的导入 外源基因整合与表达的检测 基因转移的方法： 原核显微注射法 反转录病毒感染胚胎法 胚胎干细胞法（ES细胞途径） 体外转染生殖细胞法：精子载体法、卵子载体法、受精卵载体法、胞浆内精子注射法 体内转染生殖细胞法：转染精子细胞法、精原干细胞载体法 人工酵母染色体转基因法：电脉冲法 转基因动物的理论和实践意义 基因表达与调控的研究 优良动物育种 制作人类疾病及遗传病的转基因动物模型 肿瘤发生机制研究及肿瘤预防和治疗方面的应用 利用转基因动物作为“生物反应器”生产目的蛋白 在异种器官移植中的应用 (五）细胞拆合 物理法 机械方法或短波光去核 化学法 松胞素B 离心 核体karyoplast （小细胞minicell） 胞质体cytoplast （六）哺乳动物克隆技术 克隆动物在畜牧业和 医学方面的意义 快速培育出大量的优良品种家畜 用于药物检测上，可避免动物实验的背景干扰，结果将更加稳定可靠 保护濒危动物 用于组织器官移植 与转基因动物技术结合提高转基因动物生产效率 克隆动物的方法 胚胎分割 胚胎细胞核移植 连续细胞核移植 体细胞核移植 核移植克隆程序 卵母细胞去核 核供体的准备 核移植 融合和激活 重构克隆胚胎的发育 “多莉羊”方面所存在的问题： 1）“多莉羊”是不是“克隆羊”？ 回答：是， 因为已证明它的供体细胞核是来自一种雌羊，而它的受体细胞质是来自另一种雌羊，而且它本身是雌性。 2）“多莉羊”是不是有发育的全能性？ 回答：是， 因为已证明它能和别的雄性羊交配产生后代。 3）“多莉羊”是不是来自已完全分化的乳腺细胞？ 回答：（a）证据不足，因为作者自己报道所用的培养乳腺中约有10%为非乳腺细胞，其中可能还包含未分化的胚胎细胞、干细胞和其他处于不同分化阶段的、正在分化中的乳腺细胞；(2) 而乳腺细胞又是一种不断更新的细胞，因此它们的未分化的后备细胞是很多的。 4）“多莉羊”的实验是不是能重复？ 回答：作者发表声明“不重复”。据报道当时美国Wisconsin大学的科学家进行了初步重复，但后来放弃了。 5）“多莉羊”的实验中所用的、经饥饿培养后的 “休眠”细胞是否为克隆技术成功之关键？ 回答：不一定。(a) 从理论基础的研究来看，一般不直接用身上的体细胞而用培养后的细胞来克隆动物，其原因之一就是要先促使它们恢复分裂的能力。（b）美国马萨诸塞大学研究小组声称，他们研究克隆转基因的牛犊中采用 “休眠”细胞的可能性“非常之小”（c）夏成夷大学在宣布克隆成功二代50余只克隆鼠后，据称他们自己采用的是“火奴鲁鲁技术”’，与“休眠”技术相比。这一技术存在诸多相异和改进之处，因而最后他们还申请自己的专利。 6）在专利的保护伞下，技术不公开。那么怎么样来判断生产品的真伪呢？ 回答：到目前为止和可见的将来是不可能的。 如以“多莉羊”为例：上报的专利是用“休眠”体细胞技术。 《治疗性克隆》课题被列为国家级重点基础研究项目。此课题分为上、中、下游三块，上海市转基因研究中心成国祥博士负责上游研究，上海第二医科大学盛珍教授和曹谊林教授分别主持中、下游的研究工作。 “我国器官克隆进入临床阶段” 我国科学家已成功复制了羊颅骨、鸡肌腱和猪关节软骨等组织，这意味着复制人体组织器官研究已进入了一个新阶段。国家“973计划”组织工程的基础研究项目首席科学家、上海第二医科大学附属第九人民医院曹谊林教授。他向记者证实说，我国的组织器官复制研究即将进入临床实验，即人体组织器官复制阶段，并争取在3至5年内取得突破。 我国克隆鱼。 1．1963年童第周等首先报道在鱼类中建立胚胎“细胞核移植”即“克隆”技术。 2．1972年童第周等首先报道在鱼类中获得了“核质杂种克隆鱼幼鱼” 3．1980年童第周等首先报道在鱼类中获得了“核质杂种克隆鱼” 迄今在动物界进行过核移植研究的，按首次报导的先后有: 1) 1939:变形虫(Commandon de 和 Fonbrune) 2) 1952:两栖类(Briggs 和 King) 3) 1963鱼类 (童第周等) 4) 1967昆虫 (Du Praw) 5) 1977脊索椎动物 (童第周等) 6) 1980 哺乳类 ( Illmensee等 ) 等六大类动物。 迄今在动物界进行过核移植研究的，按首次报导的先后有: 1) 1939:变形虫(Commandon de 和 Fonbrune)、 2) 1952:两栖类(Briggs 和 King)、 3) 1963鱼类 (童第周等) 、4) 1967昆虫 (Du Praw)、5) 1977脊索椎动物 (童第周等) 6) 1980 哺乳类 ( Illmensee等 ) 等六大类动物。 其中在进化上介乎两栖类和哺乳类之间的爬虫类和鸟类则至今无人问津。对鱼类进行核移植研究是由中国的童第周等（1963）首创的。它比两栖类的研究晚了约十年，比哺乳类者早18 年。但从1963 年到1999 年的 36 年间，在国外只见到由前苏联作者（Gasaryan, 1979）和日本作者（Niwa 等，1999,2001）发表过三篇论文。其它的都是中国科学家的研究结果，所以说中国在鱼类细胞核移植（克隆）研究方面，至今一直是独占鳌头。这并非 “夸大其词”，就连国际的同行们也都公认这一点（见 DiBeradino,1997[3], Yan,1998[4]）。 北京农影摄制的“移核鱼”电影在1986年捷克NITRA举办的“第三届国际农业电影节上获 “科普A类一等奖”。 同时获“联合国粮农组织奖”。 三、干细胞技术 胚胎干细胞 （embryonic stem cell，简称ES细胞） 成体干细胞（adult stem cells,ASCs） Where to get the stem cells? a. Embryonic stem cells b. Adult stem cells c. Umbilical cord (脐带) blood stem cells d. Fetal (胎儿)stem cells Why do researchers study stem cells ? For repairing tissue damage caused by disease or injury, including: Diseases that impair brain function, such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease Spinal cord (脊髓) injuries Blood diseases, including leukemias (白血病) Burns Stem cell plasticity Adult stem cells can differentiate into a large number of different cell types. 利用干细胞可塑性 Stem cells migrate to sites of organ damage and differentiate to cell types competent to participate in tissue regeneration. 胚胎干细胞embryonic stem cell（ES）：具有与胚胎细胞相似的形态，体外在滋养层细胞上或在含有白血病抑制因子的培养基中培养,可以维持其未分化状态， 在适当条件下，又可被诱导分化，具有像胚胎那样高度分化的潜能。 胚胎干细胞特点 ES细胞像胚胎细胞一样具有发育多能性，而且可以在体外培养、传代 ES细胞在不同生长条件下具有不同的功能状态 胚胎干细胞系建立的方法 显微操纵法：收集和体外培养延缓着床的胚泡，结果滋养外胚层细胞贴壁生长，而ICM细胞发育成卵柱状结构，挑出这种柱状结构，胰酶消化后继续培养、传代 。 免疫手术法：将鼠的囊胚用兔的抗血清处理，然后移至含豚鼠补体的溶液中，囊胚的滋养层细胞就成为空泡状，剔除以后只剩下内细胞团。 胚胎干细胞应用： 制作转基因动物 基因打靶 药学研究 作为组织工程的种子细胞克隆细胞和组织器官 基因敲除gene knock out： 通过同源重组，将外源突变基因取代染色体上特定的 正常基因。 基因打靶gene targeting ： 带有与整合部位相同序列的外源DNA在特定的染色体部位定点整合。 Knockout Mice The technique used to generate knockout mice was developed in the late 1980s by Marlo Capecchi at the University of Utah. 实验分三步∶ ◆构建重组体； ◆转基因敲除； ◆筛选。 成体干细胞分子标记 β1整合蛋白是表皮干细胞的分子标记 SP（side population）细胞：与DNA特异结合的染料Hoechst33342弱着色的细胞群，多种组织（包括肌肉、骨髓、上皮组织）中，Bcrp1/ABCG2基因被认为是决定SP的遗传学基础 成体干细胞的理论研究意义 向传统的细胞分化和细胞周期理论提出了挑战，成为细胞生长发育理论的极好研究对象。 成体干细胞在许多生物学行为上与癌细胞相似，成了研究癌症发生机理新的切入点。 成体干细胞的临床应用价值 可望利用成体干细胞修复创伤，治疗各种疾病，并介入生物材料学和整形外科学。 成体干细胞是组织工程的理想种子细胞，以干细胞为种子的人工皮肤、骨、肌腱、血管、角膜、肌肉、神经等正在实验室形成。 细胞拆合的方法有哪些？ 何谓胞质体、核质体？如何获取胚胎干细胞？有何用途？ 转基因动物技术的步骤有哪些 有何用途？哺乳动物克隆技术的原理和方法有哪些？有何用途？