PCR实验室芯片检测系统

盘点：分子诊断5大主流技术平台导读截止2019年3月，分子诊断产品获批数量达1197项。

按照技术原理，可以将上市分子诊断技术大致划分为PCR技术、分子杂交、基因测序、核酸质谱、生物芯片5大类。

未来3-5年IVD行业最具发展潜力的产品线是什么？答案无疑是分子诊断。

狭义的分子诊断是基于核酸的诊断技术。

随着基因组学、蛋白组学、代谢组学等新兴学科的发展，分子诊断的内涵已经从DNA/RNA拷贝、突变等检测，拓展到核酸与DNA片段、蛋白与多肽、抗原与抗体、受体与配体等生物大分子的检测。

从目前市场分子诊断产品来看，基于核酸诊断技术的产品仍占主要。

分子诊断技术体系一、PCR从各类技术类别来看，PCR技术由于壁垒相对较低，国产化程度高，国内企业布局相对较早，因此基于PCR技术的分子诊断产品占总产品量的70%以上。

PCR技术是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，基本原理是在反应室中模拟细胞内的DNA复制，即人为创造核酸半保留复制条件，使目的DNA在细胞外完成扩增的过程。

通过PCR技术进行分子诊断的流程如下：核酸提取——核酸扩增——核酸检测。

按照靶标数量划分，PCR技术平台通常可分为qPCR和ddPCR。

实时荧光定量PCR(qPCR)Real-time PCR，美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与普通PCR相比，实时定量PCR具有许多优点：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板的定量分析。

ddPCR(数字PCR)ddPCR系统利用油包水技术，在传统的PCR扩增前将一个大的反应体系进行微滴化处理，将此反应体系分割为成千上万个微滴，即成千上万个独立的PCR反应体系。

在此过程中，样品被稀释至单分子水平，并被平均分配到这几万个反应体系中，每个微滴中不含或者含有至少一个待检测的核酸靶分子，这样也相当于变相的对靶基因进行富集。

HiScanSQ系统介绍两种久经考验的技术，一个强大的平台——同一系统兼备芯片分析和测序能力HiScanSQ特点为灵活性而设计将芯片的高通量处理与新一代测序的强大功能和分辨率相结合，实现广泛的应用。

久经考验的性能直接享用当下最成功、最值得信赖的芯片技术和测序技术。

一种简捷的解决方案通过一系列尖端的、令实验设置和处理步骤自动化且简便的用户界面，从而令仪器的手工操作时间最小化。

简介HiScan™ SQ（图1）将基因分型与基因表达芯片的高通量能力与新一代测序的强大功能和分辨率相结合，带来了前所未有的实验设计灵活性。

该仪器特别拥有两个独立的组件：HiScan™Reader——一台高性能的扫描仪，以及SQ Module———个附加的能够实现基因组规模测序的流体设备。

HiScan Reader可作为一台适用于Illumina BeadArray™产品的高速精确的芯片扫描仪而独立地发挥作用。

有了SQ Module，系统又迅速开展Illumina的边合成边测序（SBS）技术——世界上最广泛采用的新一代测序技术。

有了HiScanSQ，过去运行芯片分析的实验室现在也有了一条通向新一代测序能力的便捷经济之路。

芯片和测序实验的整合，为遗传分析研究提供了无限的可能性。

这两种互补的技术共同为遗传学发现和验证提供了一种强有力的方法，让研究人员能够参与研究的任何进程，并对有关基因组、转录组或表观基因组方面的几乎任何问题进行探讨。

HiScanSQ支持研究人员：借助定向重测序进行全基因组关联研究（GWAS）的后续研究。

在基因表达的芯片分析和基因表达的测序分析之间转换。

验证从芯片分析所得的表达数据和剪接变体的数据。

从测序实验中鉴定目标SNP，以设计任何物种和任何研究的iSelect®定制基因分型组合。

图1：HiScanSQ系统HiScanSQ系统包含两个独立的组件：HiScan™ Reader（左）和SQ Module（右）。

多重荧光定量pcr1.引言1.1 概述多重荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR 技术的分子生物学方法，它结合了荧光探针技术和多重荧光信号检测技术，能够同时检测多个DNA序列。

PCR技术是一种体外复制DNA的方法，通过选择性增加目标DNA序列的数量，从而使其在样本中能够被检测到。

传统的PCR方法只能检测单个目标序列，而多重荧光定量PCR则在此基础上进行了扩展，可以同时检测多个不同的目标序列。

多重荧光定量PCR的原理基本与传统PCR相同，其中关键的步骤包括：DNA的变性、引物的结合、DNA合成和荧光信号的检测。

不同的是，多重荧光定量PCR使用多组荧光探针，每个探针与目标序列特异性结合，通过不同的波长荧光信号来唯一识别不同的目标序列。

多重荧光定量PCR在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。

它可以用于基因表达分析、病原微生物检测、单核苷酸多态性（SNP）分型等领域。

与传统PCR相比，多重荧光定量PCR能够提供更准确、更快速、更高通量的检测结果，有助于加快科研进展和提高诊断效率。

多重荧光定量PCR的优势不仅限于其高灵敏度和高特异性，还包括节省时间、减少样本消耗、适用于高通量实验等。

未来，随着技术的不断进步和方法的不断改进，多重荧光定量PCR有望在更广泛的领域得到应用，为生物医学研究和临床诊断提供更多的帮助。

1.2文章结构1.2 文章结构本文将从以下几个方面对多重荧光定量PCR进行全面介绍。

首先，我们将在引言部分对多重荧光定量PCR进行概述，包括其基本原理、发展历程以及应用领域。

然后，在正文部分，我们将详细阐述多重荧光定量PCR 的原理，包括引物设计、反应体系、PCR循环程序等方面的内容。

同时，我们将介绍多重荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型分析等领域的应用情况，并举例说明其在科学研究和临床诊断中的重要性和优势。

最后，在结论部分，我们将总结多重荧光定量PCR的优势，包括高灵敏度、高特异性、多样化的检测目标等，并展望其未来的发展方向，如在单细胞分析、微流控芯片技术等方面的应用前景。

微滴式数字PCR技术的研究进展聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是Kary Mullis等人提出的一种人工扩增DNA的方法，从一开始就在生物技术、细胞生物学、分子生物学等各个领域得到了广泛应用[1]。

在第一代PCR技术中，模板DNA、引物、DNA 聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)和缓冲溶液被混合在一起，经历变性、退火、延伸一系列热循环，产生数百万个模板DNA拷贝，通过扩增子的片段大小对靶基因进行定性检测。

随着PCR方法的不断改进，PCR也由定性分析发展到定量分析。

数字PCR(digital PCR，dPCR)将传统PCR的指数信号转换成线性数字信号，并在仪器中利用统计学方法分析PCR产物，在DNA定量分析方面有着显著优势。

伴随微流控领域的不断发展，与数字PCR技术结合所衍生出的微滴式、微孔式、微腔式数字PCR等，相比于传统数字PCR，其灵敏度和精准度有了很大提升，且操作简单，样品消耗量少。

因此，自数字PCR问世以来，已在精准医疗[2–4]、微生物检测[5–8]、食品安全[9-10]等多个领域获得广泛应用。

1 数字PCR技术“数字PCR”一词由Vogelstein和Kinzler在1999年创造[11]。

他们的开创性论文报道了一种将PCR的指数型函数转换为线性函数的新方法。

在市售的384孔板上对结、直肠癌患者的粪便样本进行了实验，实验成功地证明了在患有结、直肠癌患者的粪便样本中存在突变的KRAS基因。

在dPCR中，含有PCR反应混合物以及必要荧光团的反应溶液，被有限稀释为数以万计的较小单元，每个单元经历着与传统PCR相同的热循环。

通过荧光染料可以识别出PCR反应阳性的单元，将含有正荧光的独立单元被认为是“1”，而没有荧光或负荧光的独立单元被认为是“0”，类似于数字电子学中的信号，根据相对比例和反应器的体积，利用泊松分布统计原理可以推算出原始溶液的核酸浓度[12-13]。

无菌工艺快速微生物检测方法自21世纪初以来，国际制药工业界在无菌药品生产领域开展了一项重要的检测技术——快速微生物检测（RMM，Rapid Microbiological Methods），包含快速检出和鉴定。

在多年制药工业实践中，许多实验室发现当微生物养分被剥夺，或抗菌剂，如防腐剂、消毒剂、高温蒸汽或去污染气体的浓度达亚致死量时，微生物会发生应激，无法在传统人工介质上复制培养。

因为这种培养不能达到最佳复活条件，微生物不能增殖。

当这种情况发生时，无菌培养阴性不能证明产品没有受到污染。

另外，无菌培养需时较长，不能实时发现产品生产过程中发生的污染，不能使产品快速放行，增加仓储时间和成本。

于是，人们希望开发出新的微生物检查、定量和鉴定方法。

近年来生物检测技术高速发展并迅速向制药领域渗透。

当前RMM各类技术平台已经能够检测到多种微生物及变异微生物；能明确样品中微生物的数目；识别微生物的属，种和亚种。

这些技术主要分为基于微生物培养的快速发现和鉴定技术、活细胞识别鉴定技术和基因及芯片识别鉴定技术。

基于微生物培养的快速发现和鉴定技术基于微生物培养的快速发现和鉴定技术是在微生物培养过程中早期快速发现微生物生长。

电阻监测系统能测量微生物生长过程中液体介质中电势的变化。

微生物生长过程中，较大的，不带电的分子分解为较小的，高度带电的分子，如蛋白质变成氨基酸，脂肪变成脂肪酸，多糖变成乳酸等。

通过监测电极间离子移动（电导率）或电极表面电荷数量（电容），检查是否有微生物生长。

bioMérieux Bactometer 系统就是基于这一原理。

微生物液体培养时会产生CO2，在密闭容器中，可通过监测容器中CO2含量的变化来检测微生物生长。

BacT/ALERT系统设备是bioMérieux的第二代技术。

该技术将微生物生长产生的二氧化碳扩散至液体乳胶传感器，触发颜色警报器，告知用户检测到微生物。

Genzyme Biosurgery已将这种技术用于其细胞培养产品的快速无菌检查。

filmarray检测原理一、引言FilmArray是一种快速、可靠、高通量的分子诊断技术，可以在一个小时内检测出多种病原体。

它通过PCR扩增和电泳分离的方式对样本中的核酸进行检测。

本文将详细介绍FilmArray检测原理。

二、样品处理首先，需要对样品进行处理，以便于电泳分离和PCR扩增。

FilmArray使用的是裂解剂和磁珠技术来提取样品中的核酸。

首先，样品加入到试管中，并加入裂解剂，使细胞壁破裂并释放核酸。

然后，加入磁珠来吸附核酸，并将其从其他杂质中分离出来。

最后，用洗涤液洗去杂质，并用缓冲液溶解核酸。

三、PCR扩增接下来，对样品中的核酸进行PCR扩增。

FilmArray使用了一种多重PCR技术，可以同时扩增多个基因片段。

这种技术被称为Nested PCR（嵌套式PCR）。

Nested PCR包括两轮PCR反应：第一轮PCR 反应扩增目标DNA片段；第二轮PCR反应在第一轮反应产物基础上扩增内部片段。

Nested PCR可以提高PCR反应的特异性和敏感性。

四、电泳分离PCR扩增后，需要将产物进行电泳分离。

FilmArray使用微流控芯片来进行电泳分离。

微流控芯片是一种微型实验室，可以在非常小的空间内完成多个反应步骤。

在FilmArray中，每个微流控芯片包含多个小孔，每个小孔都包含一种检测目标（例如细菌、病毒等）的PCR产物。

这些PCR产物被注入到小孔中，并与荧光探针结合。

然后，将荧光探针注入到小孔中，并使用激光器对其进行激发。

如果PCR产物与荧光探针结合，则会发出荧光信号。

该信号被检测器检测并记录。

五、数据分析最后，需要对收集到的数据进行分析和解读。

FilmArray使用了一种名为“查找表”的算法来解读数据。

查找表是一个预先定义好的数据库，其中包含了各种病原体的DNA序列信息以及相应的荧光信号阈值范围。

当收集到荧光信号时，算法会将其与查找表中的信息进行比对，并确定检测到的病原体种类和数量。

PCR技术的发展及应用平骏 14112822276摘要：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是1985年由美国PE- Cetus 公司的科学家Kary Banks Mullis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。

经历了近30年的技术发展，现如今PCR技术在生命科学研究以及相关的很多领域都得到广泛的应用。

本文主要对PCR的基本原理、反应组份作简要的介绍；同时也对在PCR基础上发展起来的相关技术作简要综述。

关键词：PCR技术；PCR原理；PCR新技术对核酸的研究己有100多年的历史，20世纪70年代初人们就致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想，该设想在1985年被Mullis等人实现，他们发明了具有划时代意义的聚合酶链反应[6]。

这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内从试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。

PCR技术操作简便、结果可靠，被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了深远的影响[18]。

发明人Kary Banks Mulis也因此荣获了1994年的诺贝尔化学奖。

1、PCR 技术的原理[1,2]PCR技术是模拟细胞内DNA的天然复制过程，DNA 聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。

在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3，- OH 末端，并以此为起始点，沿模板5，→3，方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

简言之，其基本原理包括3个基本反应过程：变性→退火→延伸。

PCR 反应的基本成分包括：模板DNA( 待扩增DNA )、引物、4种脱氧核苷酸( dNTPs)、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。