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植物酶抑制技术用于检测蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留_钟树明

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植物酶抑制技术用于检测蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留

钟树明 袁东星 金晓英 许鹏翔(厦门大学环境科学研究中心,海洋环境科学教育部重点实验室,厦门,361005)

摘 要 应用植物酶抑制技术检测蔬菜中的有机磷及氨基甲酸酯类农药.用小柱对样品进行预处理,可去除叶绿素的干扰、提高检测灵敏度.提出了抑制率阈值(15%).应用本方法对市售蔬菜的农药残留进行了调查,检出率约为10%.关键词:蔬菜,有机磷农药,氨基甲酸酯类农药,植物酶,抑制率.

利用有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的特异抑制作用发展的酶化学比色分析法,已广泛应用于痕量和微量有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的检测[1,2],但是乙酰胆碱酯酶来源于动物体,材料昂贵,且保存困难.近年来发展了用植物水解酶替代乙酰胆碱酯酶的分析方法[3],该法利用植物水解酶水解206-二氯乙酰靛酚,根据反应溶液在水解前后颜色的变化,用眼睛或仪器辨别农药对酶的抑制程度.在有机磷或氨基甲酸酯类农药存在时,植物水解酶的活性受到抑制,靛酚的蓝色变浅.本研究采用小柱净化,能有效去除萃取液中的叶绿素;应用植物酶抑制技术检测蔬菜中的有机磷及氨基甲酸酯类农药;并根据有关标准提出了抑制率阈值.

1 仪器和试剂BECKMANDU-8B紫外-可见分光光度计,带恒温装置(美国产),XK95-Ñ型多用振荡器(江苏新康仪器厂),LD4-2离心机(北京医用离心机厂).206-二氯乙酰靛酚指示剂[4]:取011mol干燥的206-二氯靛酚钠盐(德国产,上海试剂有限公司进口分装)于锥形瓶中,加入013mol的乙酸酐,在振荡器中振荡2h.在室温下静置1h后加入600g碎冰块,115h后过滤,滤出物用水洗后溶于乙醚中,加无水硫酸钠干燥,在水浴上蒸发至约10ml,然后加入4倍体积的石油醚稀释或加石油醚直到出现结晶为止.过滤,滤液冰冻冷却后得晶体,再用乙醚/石油醚重结晶一次.真空干燥.晶体避光保存.称取所得晶体10mg,溶于10ml104-二氧六环(分析纯,上海试剂三厂)中,即得110mg#ml-1的206-二氯乙酰靛酚指示剂,避光保存.磷酸盐缓冲液(011mol#l-1):混合9417ml011mol#l-1磷酸氢二钠溶液和513ml011mol#l-1磷酸二氢钠溶液,得pH值为810的磷酸盐缓冲液.面粉酶溶液[5]:称取5g市售面粉于锥形瓶中,加入20ml蒸馏水,在振荡器上振荡30min,以2000)3000r#min-1在离心机上离心10min,上清液用针筒式过滤器过滤,得面

第21卷 第2期2002年 3月环 境 化 学ENVIRONMENTALCHEMISTRYVol.21,No.2 March 2002 粉酶溶液,置于4e冰箱中保存.50%甲胺磷乳油(福建省三农公司),50%辛硫磷乳油(江苏省城市利民化工厂),增效甲基异柳磷乳油(青岛双收农药公司),80%敌敌畏乳油(江苏梅兰公司),氧化乐果乳油(中国人民解放军第九七一五工厂),1715%增效水胺硫磷乳油(湖北省仙桃市农药厂),40%乐果乳油(沈阳新城化工公司),敌百虫原粉(南宁化学工业集团),3%呋喃丹粒剂(南宁化学工业集团).

2 样品预处理预处理柱:在直径1cm的10ml塑料离心试管下部钻一直径约为2mm的小孔,依次填入少量玻璃纤维和1g硅藻土545(上海试剂有限公司进口分装).取蔬菜菜叶10g,适当剪碎,置于25ml离心管中,加入10ml磷酸盐缓冲液,振荡1min,将液体倒入预处理柱,接收流出液,即为样品溶液[3].

3 定性和定量分析定性分析:取两支试管,一支加样品溶液217ml,另一支加磷酸盐缓冲溶液217ml,分别加入012ml植物酶溶液,于40e下恒温10min,分别加入011ml206-二氯乙酰靛酚指示剂,40e下再恒温10min,对比两试管中溶液的颜色.若样品管溶液的蓝色较浅或呈现橙色,说明酶活性受到抑制,样品中含有机磷或氨基甲酸酯类农药.标准工作曲线的绘制:在1cm比色皿中依次加入214ml磷酸盐缓冲液、013ml农药水溶液(使最终浓度分别为01010,01033,01067,0110,0133,0167,110,313,617,1010,3313,10010mg#l-1)、012ml植物酶溶液,在40e下恒温10min,于605nm处读取吸光值.然后加入011ml206-二氯乙酰靛酚指示剂,40e下再恒温10min,于605nm处读取吸光值.用磷酸盐缓冲液替代农药溶液,在同上的操作下,得空白溶液的吸光值,按下式计算抑制百分率.抑制率(%)=($A空白-$A样品)$A空白@100式中,$A空白表示显色前后空白溶液的吸光值变化;$A样品表示样品的吸光值变化.定量分析:采用外标法.抑制率与样品中有机磷及氨基甲酸酯类农药浓度的对数成正比[6],以抑制百分率对样品中农药浓度的对数作图,得标准工作曲线.

4 萃取液中叶绿素的去除对方法灵敏度的贡献叶类蔬菜在预处理过程中,叶绿素和其它杂质也同农药一起被萃取出来,绿色的叶绿素对显色反应有影响,因此,把叶绿素等杂质从萃取液中去除是提高方法灵敏度的有效途径.报道的方法是取萃取液的上清液[7]或通过铺有硅藻土545的滤纸过滤[8].叶类蔬菜样品体积较大,在萃取液一定的情况下,不易得到上清液.通过铺有硅藻土545的滤纸过滤能取得一定的去除叶绿素的效果,但过滤时间长,吸附剂用量大.分别取未过柱的样品萃取液和过柱后的样品萃取液,在波长645nm读取吸光值,叶绿素去除效果以过柱后样品的吸光值A过柱与未过柱样品的吸光值A未过柱的百分比率表

190环 境 化 学 21卷示,叶绿素通过不同吸附剂后的残留率分别为:滤纸7013%,硅镁型吸附剂1719%,201红色担体3410%,硅藻土545为1514%.硅镁型吸附剂和硅藻土545对叶绿素有很好的吸附作用.分别取未过柱的农药溶液和过柱后的农药溶液,对比它们的抑制率值,可判断农药被吸附剂吸附的情况.用同一农药溶液试验,以过柱后的样品抑制率与未过柱后的样品抑制率的百分比率表示样品经预处理后农药的保留,硅镁型吸附剂(6212%)对农药有一定的吸附作用,而硅藻土545(9910%)对农药的吸附作用可以忽略.因硅藻土545对叶绿素去除效果好且不影响样品中农药的浓度,故选其作为预处理柱填充材料.比较了填有不同量硅藻土545的预处理柱对叶绿素和农药的吸附情况,发现1g硅藻土545就能有效提高方法灵敏度.故此选用填有1g硅藻土545的小柱作为样品预处理柱.

5 敌敌畏浓度与抑制率的关系以敌敌畏浓度的对数对抑制率作图,关系曲线如图1所示.从图1可以看出,当敌敌畏浓度在0101mg#l-1)011mg#l-1时,浓度的对数与抑制率基本呈线性关系.

图1 敌敌畏浓度的对数与抑制率的关系曲线Fig11 RelationshipbetweeninhibitionandlogarithmsofDDVPconcentration

农药加酶混合后的恒温时间与酶活性被抑制程度密切相关,一般恒温时间愈长,反应时间愈长,酶活性被抑制程度愈高,所以要严格控制恒温反应时间,以保证数据的准确性.

6 方法测定限和相对标准偏差用各种农药配成一系列不同浓度的水溶液,按实验步骤进行测定.考虑到方法的测定误差,以抑制率10%作为方法测定限的标准,各种农药的测定限(mg#l-1)分别为:甲胺磷(01012),敌敌畏(010040),乐果(01048),氧化乐果(0117),甲基异柳磷(010015),水胺硫磷(0115),辛硫磷(0110),敌百虫(010074),呋喃丹(0133).将同一农药水溶液平均分成5份,按实验步骤测定,得方法的相对标准偏差为118%,说明方法的精密度较高.

191 2期 钟树明等:植物酶抑制技术用于检测蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留7 抑制率阈值的估算按已建立的实验方法,可以得到几种常用的有机磷及氨基甲酸酯类农药的浓度对数与抑制率值之间的关系,如表1所示.我国已制定了一些农药的最大允许残留量(Max-imumResidueLimit,MRL),部分农药的最大允许残留量和根据实验计算出的对应抑制率值也列于表1中.从表1可以看出,不同农药的最大允许残留量所对应的抑制率值是不同的,根据FAO/WHO1985年第16届食品法典委员会所采纳的农药残留最高限量标准,各种农药残留在011)10mg#l-1范围.本方法除辛硫磷和呋喃丹外,对其它农药均能满意地检测.考虑方法测定限、误差、萃取效率、不同蔬菜对反应的影响等综合因素,可以拟定抑制率值15%为抑制率阈值.如果抑制率大于或等于15%,表示蔬菜中农药含量超标;如果检测抑制率小于15%,表示蔬菜合格,从而建立了蔬菜中农药残留快速检测方法.

表1 几种常用有机磷及氨基甲酸酯类农药浓度对数与抑制率的关系和蔬菜中最大允许残留量及其对应的抑制率值Table1 Relationshipbetweenpercentinhibitionandlogarithmsofdifferentorganophosphorusandcarbamatepesticides

农药通用名最大允许残留量[9](mg#kg-1)浓度对数x与抑制率y的关系式最大允许残留量对应的抑制率值/%

甲胺磷稻米(011)y=12194x+341812119敌敌畏蔬菜(011)y=34142x+921415810乐果蔬菜(110)y=41412x+151811518氧化乐果暂无标准,参考乐果y=81093x+161311613甲基异柳磷暂无标准(取011)y=10114x+381762816辛硫磷蔬菜(0105)y=13136x+23137610水胺硫磷暂无标准,参考亚胺硫磷(015)y=71631x+161281410敌百虫蔬菜(011)y=11167x+341852312呋喃丹(克百威)糙米(012)y=91904x+141727180

8 植物酶法与标准方法的比较为了验证方法的可靠性,取喷洒不同浓度久效磷农药的同一蔬菜样品,用已建立的植物酶法与国家标准法[10]进行分析测定.当喷洒浓度为510mg#l-1时,用国家标准气相色谱法测定的结果为0123mg#l-1,植物酶法为0113mg#l-1;当喷洒浓度为110mg#l-1时,检测的结果为:国家标准气相色谱法为01047mg#l-1,而植物酶法为01029mg#l-1.对于水溶性的农药乳油,与标准气相色谱法相比,植物酶法的检测结果略低些,但已能满足检测的要求.由于气相色谱法的萃取和检测,操作复杂,需要使用大量的二氯甲烷等有机溶剂,而植物酶法在测定过程中无需使用有机溶剂,预处理方法简单,测定速度较快,成本低廉.应用所建立的方法抽样对市场出售的新鲜蔬菜进行农药残留检测,检出率约为10%.

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农药残留检测流程(酶抑制法)

农药残留检测流程(酶抑制法)

农药残留检测流程【简介】农药残留是指在农业生产中施用农药后一部分农药直接或间接残存于谷物、蔬菜、果品中的现象。

有机磷和氨基甲酸酯类农药中存在着部分高毒和剧毒品种，如果被施用于生长期较短、连续采收的蔬菜，则很难避免因残留量超标而导致人畜中毒。

农药进入粮食、蔬菜、水果中，造成食物污染，危害人的健康。

由于农药残留对人和生物危害很大，各国对农药的施用都进行严格的管理，并对食品中农药残留容许量作了规定。

【检测原理】有机磷或氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的活性具有抑制作用，通过测定该酶的活性被抑制的程度即可知样品中含有农药的残留情况。

计算公式：抑制率(%)=(ΔA0-ΔA i)/ ΔA0×100%【检测对象】粮食、蔬菜、水果等【试剂配制】①缓冲液：将缓冲液试剂袋中的试剂倒出，溶于500mL 蒸馏水中，溶解、混匀即可。

②底物：往标注为底物的瓶中加入13mL蒸馏水。

2~4ºC环境下冷藏保存。

③显色剂：无需配制放入冰箱冷藏（2~4ºC），切勿冷冻结冰。

④酶试剂：酶试剂已配成溶液可直接使用。

平常要在2~4ºC环境条件下冷藏保存！【操作步骤】1.样品前处理：(1) ①植株：称取2.0g样品（叶菜剪成宽度为1厘米的菜样，块根菜取1厘米左右的表皮样品）放入三角瓶中，加入10mL缓冲液后，振荡提取2分钟；②茶叶：称取0.5g茶叶样品，加入5ml丙酮，振荡提取5分钟；取0.2mL上述丙酮溶液，40~50℃水浴蒸干；加入2.5mL缓冲液，振荡2分钟；[备注]：葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中含有对酶有影响的植物次生物质，易产生假阳性。

处理这类样品时，可采取整株浸提，避免次生物物质干扰。

2.检测样品的制备：(1) 空白对照液:①取酶100μL，缓冲液2.5mL，加入专用反应瓶中，再加入显色剂100μL，静置15分钟（35度恒温更佳）。

②加入底物100μL；③摇匀后立即测试。

蔬菜农药残留快速检测技术

蔬菜农药残留快速检测技术

蔬菜农药残留快速检测基础知识一、蔬菜农药残留酶抑制法检测原理农残速测仪检测原理是酶抑制法，在必然条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性，其抑制率与农药的浓度呈正相关。

在正常情况下，酶催化代谢产物水解，其水解产物与显色剂反映，产生黄色物质，用分光光度计在410纳米处测定吸光度随时间的转变值，计算出抑制率，通过抑制率的大小可以判断样品中是不是有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

二、农药残留速测法检测对象一、有机磷类农药包括：甲胺磷、水胺硫磷、乐果、敌百虫、敌敌畏、氧化乐果、马拉硫磷、甲基异柳磷、辛硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、乙酰甲胺磷、久效磷、杀螟硫磷、倍硫磷、毒死蜱等。

二、氨基甲酸酯类农药包括：叶蝉散、速灭威、西维因、涕灭威、克百威（呋喃丹）、异丙威、灭多威等。

三、农药残留速测法依据的标准中华人民共和国国家标准GB/—2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会发布四、检测方式一、准备阶段试剂或条件发生转变及时间距离比较长时，应重做。

①开机预热15分钟。

②仪器调0。

③仪器调100。

④制作对照。

第①、②、③步在天天利用前必需做，在改换新一瓶试剂时也必需做。

二、对照①在干净的试管顶用移液管加入提取液。

②用移液器提取的酶，加入到试管中。

③用移液器提取的显色剂，加入到试管中。

④适度晃动试管，使液体混合均匀，25℃左右的温度放置15分钟。

⑤15分钟后，用移液器提取的底物，加入到试管中，晃动试管，使液体混合均匀，马上倒入比色皿中，放入仪器1通道，按启动键开始检测。

⑥时间到后显示对照结果，一般对照值应在30以上，按Y保留，对照结束。

3、样品检测液①用天平称取表面干净蔬菜或水果1g剪成1cm左右的方块，放入小烧杯中。

②用移液器提取5ml的提取液用振荡器震荡2分钟。

③将烧杯中的液体用移液器提取的上清液到试管中，为检测液。

酶抑制法在蔬菜农药残留快速检测中的应用

酶抑制法在蔬菜农药残留快速检测中的应用

酶抑制法在蔬菜农药残留快速检测中的应用
酶抑制法是一种常用的蔬菜农药残留快速检测方法，它利用酶与农药之间的相互作用来检测农药残留水平。

本文将介绍酶抑制法在蔬菜农药残留快速检测中的应用及其优势。

酶抑制法具有快速的检测速度。

测定农药残留的时间通常只需要几分钟到几小时，相比其他传统的检测方法，如色谱分析法和质谱分析法，酶抑制法具有更快的检测速度。

酶抑制法具有较高的灵敏度。

酶抑制法可以测定非常低浓度的农药残留，一般可以检测到PPB（亿分之一克）级别的残留水平。

该方法对于检测蔬菜中微量农药残留非常有效。

酶抑制法操作简单、方便。

相比其他复杂的仪器设备，酶抑制法所需的设备简单，操作流程也相对简单。

一般只需要将样品与试剂混合，置于适当的温度下反应一定时间后，通过测定酶的活性变化来判断农药的残留水平。

酶抑制法常用于高效液相色谱法（HPLC）的辅助方法，通过酶抑制活动的检测，可以验证HPLC的结果，提高检测的准确性。

酶抑制法可以用于筛选具有酶抑制活性的化合物，快速鉴定农药中可能存在的残留物。

酶抑制法还可以用于检测不同农药对酶的抑制能力的差异，评估农药对环境和人体的毒性。

酶抑制法也可以用于农药残留的快速检测实时监控，通过实时监测农药残留的变化，可以及时采取相应的控制措施，保证蔬菜的质量安全。

有机磷和氨基甲酸酯类农药残留标准

有机磷和氨基甲酸酯类农药残留标准

有机磷和氨基甲酸酯类农药残留标准摘要：一、有机磷和氨基甲酸酯类农药概述二、有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的危害三、有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测方法四、我国相关标准及规定正文：一、有机磷和氨基甲酸酯类农药概述有机磷和氨基甲酸酯类农药是我国农业生产中大量使用的杀虫剂。

有机磷农药是含有有机磷的农药化合物，品种多、药效高、用途广，但部分品种对人、畜的急性毒性较强。

氨基甲酸酯类农药则是一类具有广泛应用的农药品种。

二、有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的危害有机磷和氨基甲酸酯类农药残留对人体健康造成危害，主要通过三条途径进入人体：一是偶然大量接触，如误食；二是长期接触一定量的农药，如农药厂的工人、周围居民和使用农药的农民；三是日常生活接触环境和食品、化妆品中的残留农药。

三、有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测方法有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测方法主要包括酶抑制法等。

如RP100型农药残毒速测仪，是按国家标准GB/T5009.199-2002所规定的有酶抑制率法测定蔬菜（水果）中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速测定方法所开发的检测仪器。

四、我国相关标准及规定我国对于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测标准有GB/T5009.199-2002等，同时还规定了肉中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法、酶抑制法（GB/T 18626-2002）。

这些标准旨在保障农产品质量和人体健康，对于农业生产者和消费者都具有重要的指导意义。

总结：有机磷和氨基甲酸酯类农药在我国农业生产中占据重要地位，但其残留问题不容忽视。

了解农药残留的危害、掌握检测方法以及遵循国家相关标准，有助于保障农产品质量和人体健康。