高免卵黄抗体提纯及提取液冻干的研究

作者简介胡晓苗（１９７１－），男，安徽望江人，在读硕士，助理研究员，从
事兽医研究。

收稿日期
２００６!０４!１３
由于高免卵黄抗体自身的一些缺陷，近年来在全国大部分地区禁止使用高免卵黄抗体。

其缺陷是：①卵黄抗体往往由商品蛋所制作，带由鸡霉形体、
禽白血病、鸡白痢、鸡传贫、沙门氏菌等多种病原体，这些病原体可经卵黄液的使用而垂直传播，从而引起相应的疾病。

即使卵黄液中加入一定的防腐剂和抗生素，但对病毒无效［１，２］。

另外，蛋黄中含有大量分子量很大的卵黄磷蛋白及脂肪等物质，注入肌肉难以吸收而造成局部肿胀、坏死、过敏反应［２］。

②常规卵黄抗体经稀释分装而成，体积大，运输不便。

另外，需低温保存和运输，由于反复冻融和运输不当而造成效价降低。

因此，笔者进行了卵黄体抗体的提纯和提纯液的冻干研究，旨在克服卵黄抗体的缺陷。

１卵黄抗体的提纯１．１
材料与方法
１．１．１材料。

聚乙二醇（ＰＥＧ６０００，进口分装，购自合肥大药
房）；高免鸡蛋（测其效价为１∶１２８）；法氏囊标准抗原及阳性血清（购自哈兽研）；琼脂糖粉（浙江某生物化工厂）。

１．１．２方法。

（１）提纯用高免卵黄液的制备。

将收集的高免蛋浸泡消毒，无菌分离蛋黄，经无菌搅碎机搅拌５ｍｉｎ，按１∶１加入无菌生理盐水，用双层无菌纱布过滤，加入青霉素、链霉素各１０００单位、
叠氮钠至０．０１％浓度，置４℃冰箱备用。

（２）１％琼脂糖平板：称取琼脂糖１ｇ，溶于１００ｍｌ生理盐水中，加热融化，然后乘热倒入平皿中，冷却后放入冰箱备用。

（３）ＰＢＳ缓冲液［３］。

ＫＨ２ＰＯ４１３．６ｇ、ＮａＣｌ５８．４ｇ、ＮａＣＮ３１．０ｇ，用９８００ｍｌ蒸馏水溶解，装入１万ｍｌ血清瓶，用１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调至ｐＨ值７．５（大约用１００ｍｌ），定容至刻度处，高压灭菌后备用。

（４）卵黄液中免疫球蛋白ＩｇＧ的提取［４］。

在高免卵黄液中加入４倍体积的ＰＢＳ缓冲液，充分摇匀，再加入ＰＥＧ
６０００，使其最终浓度达４％，搅拌１０ｍｉｎ后，４０００ｒ／ｍｉｎ离
心３０ｍｉｎ。

无菌收集上清液再加入ＰＥＧ６０００，使其最终浓度为１２％，搅拌１０ｍｉｎ，同上离心，弃上清液，所得产品即为粗提的ＩｇＧ。

１．２结果与分析１．２．１ＩｇＧ效价。

琼脂扩散法：将提纯的抗体稀释致原卵黄
液体积，用事先准备的琼脂糖平板，放在事先画好的７孔图案上，打孔，加入标准抗原和ＩｇＧ稀释液。

将平板放在湿盒中，置３７℃温箱中２４～４８ｈ观察，结果为平均效价１２８。

说明用此法提取ＩｇＧ时能充分提取，即效价不变。

１．２．２ＩｇＧ稀释液检验。

（１）细菌学检验。

将ＩｇＧ稀释液接种于营养琼脂试管斜面上，３７℃鸡胚培养２４ｈ，观察到无细菌生长。

（２）病毒学检验。

将９日龄ＳＰＦ鸡胚（购自山东家禽研究所）１０枚，分为２组，ＩｇＧ稀释液接种１组，０．２ｍｌ／枚；另一组作对照，接种生理盐水，３７℃鸡胚孵化５ｄ后通过照蛋，可以看出血管清晰，说明２组鸡胚均生长良好。

将鸡胚放入４℃冰箱过夜，第２天观察鸡胚，２组均未发现病变。

通过检验说明，用提纯卵黄抗体的方法，避免了细菌和病毒的垂直传播，而且排除了卵膦子等大分子物质的应激反应。

２卵黄抗体提取液的冻干
液体状的卵黄抗体在保存和运输上存在着体积大易失
活等缺点，而冷冻干燥技术能使纯化的抗体在预先冷冻的状态下，不经液态直接升华除去水分而获得干粉型制剂，它避免了液态下保存的抗体易失活易变形的缺点，使产品体积大大缩小，便于运输及能够长时间保存［５］。

２．１材料和方法
２．１．１材料。

ＩｇＧ稀释液，冷冻真空干燥机（安徽省农科院畜牧兽医研究所兽药制剂室），蔗糖，真空枪。

２．１．２
方法。

在ＩｇＧ稀释液中加入浓度５％蔗糖作为冻干
干燥剂，经定量分装机分装２ｍｌ于７ｍｌ西林瓶内，放入冷冻真空干燥机中制成冻干制剂。

用真空枪检验，如果呈现蓝色荧光，表明瓶内处于真空保存状态，为合格产品。

２．２结果与分析
２．２．１
安全性检验。

取３０日龄健康鸡（河南故始三高集团
提供）２０只，分为２组，一组肌注冻干稀释液（１∶４倍稀释，即每瓶加生理盐水８ｍｌ，稀释后效价为１∶３２）２ｍｌ，另一组肌注
４ｍｌ，观察１０ｄ。

结果２组精神状态一直良好，临床未见异
常表现，剖检未见病变，说明ＩｇＧ冻干制剂使用安全。

２．２．２抗体冻干前后的效价测定。

琼脂扩散法测定效价变
化情况：抽查２个批组，每批随机抽取１０瓶，测定结果都为
１∶１２８，说明制成冻干制剂对效价无影响。

２．２．３
温度对抗体效价的影响。

将常规未提纯卵黄抗体液
和ＩｇＧ冻干制剂于不同温度下作用一定时间后，用琼脂扩
散法测定效价变化情况，结果见表１。

（下转第２１５０页）
高免卵黄抗体提纯及提取液冻干的研究
胡晓苗１，２，李春芬２，汪丽１，赵磊２
（１．安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥２３００３１；２．安徽农业大学动物科技学院，安徽
合肥２３００３６）
摘要针对高免卵黄抗体的缺陷，采用聚乙二醇法提纯卵黄抗体ＩｇＧ，ＩｇＧ稀释为原卵黄液体积时效价不变，为１∶１２８，细菌和病毒学检验均为阴性。

将ＩｇＧ稀释液制成冻干制剂，实验表明冻干后效价不变且对温度的抵抗力大大提高，冻干制剂防治效果良好。

说明此
种方法可避免常规卵黄抗体临床传播疫病的危险，运输和保存更加方便，真正做到了安全、
高效。

关键词卵黄抗体；提纯；ＩｇＧ；冻干；琼脂扩散法中图分类号Ｑ９５９．９文献标识码Ａ文章编号０５１７－６６１１（２００６）１０－２１４７－０１
安徽农业科学，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００６，３４（１０）：２１４７，２１５０责任编辑曹淑华责任校对曹淑华
表１
温度和时间对２种不同剂型抗体效价的影响
卵黄抗体液ＩｇＧ冻干制剂
００１批００２批００３批００１批００２批００３批
６０℃１ｈ
－±±－－－３７℃３０ｄ＋＋＋＋＋＋＋＋＋±－－０～４℃琼脂糖１年＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－２０℃１年－－－－－－
注：“－”为无影响，“±”为稍有影响，“＋”为影响较小，“＋＋＋”为完全失活。

从表１可以看出，纯化的卵黄抗体冻干后对温度的耐受力大大增强，在４℃可保存１年以上，室温下可保存１个月以上。

２．２．４防治实验。

取１月龄易感病鸡（经琼脂扩散法监测为
阴性）５０只随机分成５组，每组１０只，隔离饲养。

每组处理及对鸡病的免疫效果见表２。

从表２可以看出，卵黄冻干制剂预防保护率为１００％，紧急接种和治疗时保护率９０～８０％。

笔者在合肥郊县进行现场使用观察，结果相似。

３结论与讨论
（１）通过纯化提取卵黄抗体ＩｇＧ，可彻底消除垂直传播
疫病的危险性，同时可免除卵磷蛋白等大分子物质的副作用。

（２）提纯ＩｇＧ稀释液制成冻干制剂，其效价不变，对温度的耐受力大大增强；由于冷冻干燥在低温高真空度下进行，不会改变产品中活性分子结构，产品不起泡不暴沸，且不粘壁易溶于水［６］。

所有这些为长期于室温或普通冰箱内保存提供了依据。

（３）不足之处：生产所需化学试剂量大，操作程序复杂，需要添置离心和冻干设备，由此构成的销售价格比常规卵黄抗体高。

尽管如此，笔者认为这是发挥卵黄抗体作用的一条途径。

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处理
实验鸡数
发病鸡数
死亡鸡数
保护率
％攻毒前２４ｈ注射冻干稀释液１ｍｌ
１０００１００攻毒同时注射冻干稀释液１ｍｌ１０２１９０攻毒后２４ｈ注射冻干稀释液１ｍｌ１０５２８０
肌注生理盐水１ｍｌ１０１０８不攻毒不注射组
１０００
表２卵黄抗体提取液对鸡病的免疫效果
组与对照组差异显著（Ｐ＜０．０５）。

这表明４０ｇ／ｄ的植物脂肪粉可能不太合适；添加４０ｇ／ｄ的过瘤胃脂肪有提高脂肪消化率的作用。

４结论
在绵羊日粮中添加４０ｇ／ｄ脂肪酸钙和植物脂肪粉对瘤
胃液氨态氮浓度有一定的降低作用，但试验组与对照组以及试验组与试验组之间在０．０５水平上无差异；４０ｇ／ｄ的过瘤胃脂肪添加水平有降低瘤胃ｐＨ值的作用，但作用并不显著；绵羊添加４０ｇ／ｄ的脂肪酸钙提升了干物质采食量，而添加４０ｇ／ｄ的植物脂肪粉和硬脂肪却降低干物质采食量，但过瘤胃脂肪对采食量的影响并不显著。

添加４０ｇ／ｄ过瘤胃脂肪对营养物质全消化道消化率有一定影响，其中蛋白、ＡＤＦ和ＮＤＦ消化率有一定的下降。

各种过瘤胃脂肪之间存在着一定的差异，尤其是对蛋白消化率来说影响程度不同，这方面的工作还需更深入的研究。

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（３）：２２１－２２７．［２２］ＳＴＯＲＲＹＪＥ．Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄｌｉｐｉｄｓｉｎｒｕｍｉｎａｎｔｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｇｒｉｃｔ［Ｊ］．
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（１５）：９６．!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第２１４７页）
安徽农业科学２００６年
２１５０。