流式细胞术检测Vpr蛋白对细胞周期影响实验

ＩＳＳＮ１００２－４９５６　ＣＮ１１—２０３４／Ｔ　实验技术与管理　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　第２７卷第６期２０１０年６月　Ｖｏ１．２７　Ｎｏ．６　Ｊｕｎ．２０１０　

流式细胞术检测Ｖｐｒ蛋白对细胞　

周期影响实验　

王小利，杨怡姝，孙晓娜，肖向茜，沈思嗣　

（北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京　１００１２４）　

摘　要：流式细胞术是生物学领域重要的检测技术。为实现实验教学与科研工作的紧密结合，该设计采用流　

式细胞仪检测表达绿色荧光蛋白阳性细胞比例和细胞周期分布，分析质粒转染的效率并研究蛋白的功能。　

通过２个经典的检测方案，使学生更好地理解和掌握流式细胞术的检测原理、操作步骤及结果分析方法。　

关键词：流式细胞术；绿色荧光蛋白；Ｖｐｒ蛋白；细胞周期　

中图分类号：Ｑ＿３３；Ｇ６４２．０　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２—４９５６（２Ｏ１０）０６—００３３—０４　

Ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｖｐｒ　ｏｎ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　

Ｗａｎｇ　Ｘｉａｏｌｉ，Ｙａｎｇ　Ｙｉｓｈｕ，Ｓｕｎ　Ｘｉａｏｎａ，Ｘｉａｏ　Ｘｉａｎｇｑｉａｎ，Ｓｈｅｎ　Ｓｉｓｉ　

（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏ—ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　

Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００１２４，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｉｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｔｏ　ｃｏｍｂｉｎｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｔｅａｃｈｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｓｃｉ—　

ｅｎｔｉｆｉｃ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｃｌｏｓｅｌｙ，ｔｈｅ　ｃｏｕｒｓｅ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔＯ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｔｒａｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃ—　

ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｂｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　

ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｗｏ　ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｗｅｒｅ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｔｈｅ　

ｓｔｕｄｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｂｅｔｔｅｒ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｍａｓｔｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　

ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｙ；ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｖｐｒ；ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　

流式细胞术是对于处在快速直线流动状态中的　

细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选　

的技术，广泛应用于细胞生物学、免疫学、遗传学、血　

液学等基础科研领域，也是临床检验中重要的诊断　

手段＿１。］，流式细胞术已成为医药卫生学科、生命学　

科学生需要掌握的一项技术。流式细胞术操作比较　

复杂，学生实验课课时较短，实验经费较少，学生理　

论知识相对薄弱，如何做好流式细胞术实验教学成　

为生物技术专业教师面临的一个重要问题。　

针对多数工科院校生命科学专业的实验条件和学　

生的基础知识储备状况，本文专门设计了一例简便易　

行、用时短和结果分析具有代表性的流式细胞术实验。　

收稿日期：２００９—０７　３０　基金项目：北京工业大学研究生课程建设项目资助（ＣＲ２００８一Ｂ－０３４）；国　

家重点基础研究发展计划（２００９ＣＢ９３０２０２）；北京市自然科学　基金（５０７２００３）；北京市教委科研项目（ＫＭ２００８１０００５０１５）　作者简介：王小利（１９７７），女，河南省新乡市人，硕士，助理研究员，主　要研究方向：病毒药理学．　本实验选择病毒蛋白Ｖｐｒ对细胞周期的影响为研究　

对象。Ｖｐｒ蛋白是人类免疫缺陷病毒（ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕ—　

ｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）、猴免疫缺陷病毒（ｓｉｍａｎ　ｉｍ—　

ｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ，ＳＩＶ）和其他慢病毒中高度保守　

的蛋白，可导致宿主细胞Ｇ２／Ｍ期阻滞，使被感染细　

胞分裂停止，影响细胞周期进程，诱导细胞凋亡［４－５］。　

本实验将ｐＧＦＰ—Ｖｐｒ真核表达质粒转染ＨｅＬａ细胞，　

表达ＧＦＰ—Ｖｐｒ融合蛋白，采用流式细胞术检测绿色荧　

光蛋白（ＧＦＰ）的表达率和细胞周期，研究质粒的转染　

效率和细胞周期的变化。本实验将流式细胞术、细胞　

培养、基因克隆等相关知识点进行有机串接，实验过程　

涵盖从细胞样本处理到上机检测及结果分析的所有步　

骤，实现了流式细胞术理论知识教学与学生实际操作　

能力培养的有机融合。教学结果表明该实验深受学生　

欢迎，效果良好。　

１实验材料与仪器　

材料：ｐＧＦＰ—Ｖｐｒ质粒转染后培养４８　ｈ的ＨｅＬａ　３４　实验技术与管理　

细胞、浓度为５０　ｍｇ／Ｌ碘化丙碇（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ，　

ＰＩ）染色液（配制方法：ＰＩ　５　ｍｇ、ＲＮａｓｅ　２　ｍｇ、枸橼酸钠　

１００　ｍｇ、１．０ＺＴｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００、生理盐水６５　ｍＬ、加蒸馏　

水至１００　ｍＬ）、无水乙醇、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）、３００目　

滤网。　

仪器：倒置荧光显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、流式细胞仪　

（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ａｈｒａ）、离心机等。　

２　实验方法　

２．１样本制备　

（１）实验前准备转染细胞。将质粒转染２４孔板　

培养的ＨｅＬａ细胞（５０　成层）——转染细胞的分组如　

下：Ａ组为未转染阴性对照组；Ｂ１一Ｂ３组为转染ｐＧ—　

ＦＰ—Ｖｐｒ质粒实验组，质粒转染量为２　ｇ／孔，脂质体　

的用量分别为２　ＦＬ／￣Ｌ、３　ＦＬ／￣：Ｌ和４　Ｌ／孑Ｌ，每组设立　

４个复孔；Ｃ１一Ｃ３组为转染ｐＧＦＰ空载体对照组，质　

粒转染量为２　ｇ／孔，脂质体用量分别为为２　ＦＬ／￣：Ｌ、　

３　ＦＬ／￣Ｌ和４　Ｌ／孔，每组设立２个复孔，用于检测　

ｐＧＦＰ空载体对细胞周期的影响。　

（２）制备ＧＦＰ表达率检测样本。转染后培养　

４８　ｈ，胰酶消化，收获细胞；ＰＢＳ清洗一次，取３００　ｇ，离　

心５　ｍｉｎ，加入１　ｍＬ　ＰＢＳ，吹散成单细胞悬液。３００目　

滤网过滤，直接用来测定ＧＦＰ表达量。　

（３）制备细胞周期样本　］。加入７ｏ％的冰乙醇混　

匀，在一２Ｏ℃固定１　ｈ；固定好的细胞离心，弃去上清　

液再用ＰＢＳ漂洗１遍；加入５０　ｍｇ／Ｌ的ＰＩ染色液　

１　ｍＬ，吹散成单细胞悬液，室温避光孵育３０　ｒａｉｎ；３００　

目滤网过滤，准备上机检测。　

２．２上机检测　

（１）调节光路。按操作说明启动流式细胞仪，选　择激发光源为１５　ｍｗ氩离子激光器，激光波长为４８８　

ｎｍ。用标准荧光微球调节光路，各通道的变异系数　

（ＣＶ值）应≤２　。　

（２）选择参数，建立检测程序。根据荧光特性，　

选择检测参数：ＦＳ　Ｌｉｎｅ、ＰＭＴ１　Ｌｉｎｅ用于收集目标　

细胞；ＰＭＴ２　Ｌｏｇ收集ＧＦＰ信号；ＰＭＴ４　Ｌｉｎｅ和　

ＡＵＸ２　Ｐｅａｋ用于检测细胞周期，建立相应的二维散　

点图和单参数直方图，并设立门，建立各门间的　

关联。　

（３）样本检测。用未转染质粒的正常细胞作为阴　

性对照，在ＦＳ　Ｌｉｎｅ、ＰＭＴ１　Ｌｉｎｅ的二维散点图中，调　

节２参数电压，把目标细胞群调在收集框中央位置，设　

门选取目标细胞群；然后调节ＰＭＴ２　Ｌｏｇ电压，使　

ＰＭＴ２单参数直方图中＞１Ｏ。区域细胞所占比例＜　

２　，但不为零；检测样本ＧＦＰ的表达率；调节ＰＭＴ４　

Ｌｉｎｅ和Ａｕｘ２　Ｐｅａｋ的电压值，使目标细胞在二者建立　

的散点图中央，并设定自由门，来剔除细胞碎片、二联　

体和聚集体，在ＰＭＴ４　Ｌｉｎｅ单参数直方图收集细胞周　

期样本。在此条件下对其他样本进行检测，每个样本　

收集２万个细胞，保存并输出结果。用ＭｕｌｔｉＣｙｃｌｅ　ｆｏｒ　

Ｗｉｎｄｏｗｓ分析软件使用统一的分析模型分析采集细　

胞周期样本。　

３实验结果与讨论　

本实验是教学实验，操作的过程中要讲解相关理　

论知识、操作步骤与技巧，使学生将理论和实践更好地　

结合起来。　

３．１　ＧＦＰ表达率检测结果分析　

ＧＦＰ表达率检测结果示例如图ｌ所示。　

ＰＭＴ１　Ｌｉｎｅ　１０２３　０　

（ａ）二维散点图　

图１　ＧＦＰ检测结果示例　

图１（ａ）是侧向散射光（ＰＭＴ１　Ｌｉｎｅ）和前向散射　

光（ＦＳ　Ｌｉｎｅ）二维散点图，横轴代表侧向散射光强度，　

纵轴代表前向散射光强度，点代表细胞。Ａ是设的不　规则门，Ａ门内细胞为选定的目标细胞，Ａ门细胞占　

总收集细胞的９７．５　；图１（ｂ）是ＧＦＰ的单参数直方　

图，认为横坐标＞ＩＯ。（即Ｂ门）为表达ＧＦＰ细胞，越靠　王小利，等：流式细胞术检测Ｖｐｒ蛋白对细胞周期影响实验　

右荧光强度越强，Ｂ门为线性门，实验结果见表１。　

表１　ＨｅＬａ细胞转染２　ｇ　ｐＧＦＰ‘Ｖｐｒ质粒　４８　ｈ后ＧＦＰ阳性细胞比例　

由表１可知，当质粒量为２　ｔ￣ｇ／ＺｆＬ时，随着脂质体　

用量加大，ＧＦＰ表达率也随之升高，表明转染效率也　

相应增加。由于质粒表达的为ＧＦＰ—Ｖｐｒ融合蛋白，因　

此可以认为Ｖｐｒ蛋白的表达量亦是随之升高的。脂　

质体使用说明书推荐的剂量为２　Ｌ／孔，但在本实验　

中脂质体使用量为４　Ｌ／孔时，ＧＦＰ表达率仅达到　

（ａ）双参数散点图　

Ｌ　ｌ　Ｌ　

ＤＮＡ．ＰＩ　

（ｃ）单参数直方图　１０２３　３６．３　。需要根据选用的细胞与质粒的类型，进一步　

优化转染条件，提高ＧＦＰ的表达率。　

３．２细胞周期检测结果分析　

流式细胞仪通过获得荧光信号的面积反映ＤＮＡ　

的含量。如果２个Ｇ１期细胞粘连一起，会与Ｇ２期细　

胞具有相同的ＤＮＡ含量。因此若用ＤＮＡ直方图来　

精确反映细胞周期，必须剔除粘连的细胞。流式细胞　

仪获取的荧光信号面积与信号的宽度和峰高有关，在　

面积相同条件下，荧光宽度越大，峰高越小；荧光宽度　

越小，峰高越大。而荧光信号宽度与粒子粒径相关，单　

个细胞粒径小，荧光宽度小，２个粘连细胞粒径长，荧　

光宽度大　］。因此结合荧光面积和峰高图进行综合分　

析，可将单个细胞和粘连细胞区分开，通过设门排除粘　

连细胞。细胞周期检测结果示例如图２。　

图２细胞周期检测结果图示例　

图２（ａ）是ＦＳ　Ｌｉｎ、ＰＭＴ１　Ｌｉｎ双参数散点图，选定　

了研究的目标细胞；图２（ｂ）是ＰＩ—Ａ和ＰＩ—Ｐｅａｋ组成　

的散点图，ＰＩ通道的面积信号和峰值信号相结合，设　

门剔除了粘连细胞（Ｇ门所示）；图２（ｃ）是显示细胞　

ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）含量的单参数直方图；图　

２（ｄ）是分析软件ＭｕｌｔｉＣｙｃｌｅｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ对图２（Ｃ）　ＤＮＡ　Ｃｏｎｔｅｎｔ　

（ｄ）分析结果　

的分析结果，图中显示各时相细胞比例、峰值的变异系　

数（ｃＶ）及ＤＮＡ指数等。Ｇ１期ＤＮＡ峰的ＣＶ值可