植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定

谷氨酰胺合成酶的生物合成研究近年来，谷氨酰胺合成酶的生物合成研究成为了许多科学家和研究人员关注的热点问题。

这是因为谷氨酰胺合成酶是细胞内重要的代谢途径之一，和许多疾病的发生发展密切相关。

因此，对谷氨酰胺合成酶的生物合成研究具有重要的生物学和医学价值。

谷氨酰胺合成酶是一种负责合成谷氨酰胺的酶，谷氨酰胺是一种氨基酸，是蛋白质合成的重要原料之一。

在细胞合成谷氨酰胺时，两个分子的胺基化合物——谷酰胺和L-谷氨酸通过谷氨酰胺合成酶的作用被反应生成一分子的谷氨酰胺和一个水分子，反应式如下：谷氨酰胺 + ATP + L-谷氨酸→ ADP + Pi + L-谷氨酰胺该反应的生物学功能非常重要，因为细胞内的谷氨酰胺将参与到蛋白质代谢、细胞生长和分化、硝化和葡萄糖代谢等多种代谢途径中。

目前，针对谷氨酰胺合成酶的生物合成研究主要集中在其功能、结构和功能调控机制这三个方面。

一、谷氨酰胺合成酶的功能已经有许多研究表明，谷氨酰胺合成酶对于细胞内合成谷氨酰胺具有关键的作用，而谷氨酰胺又是多个代谢途径的重要原料之一。

此外，谷氨酰胺合成酶也能调节氮代谢和氨基酸合成等机制。

因此，谷氨酰胺合成酶在细胞内具有极其重要的功能。

二、谷氨酰胺合成酶的结构虽然在不同生物体内谷氨酰胺合成酶的组成、结构和催化机制存在差异，但是大部分细菌和真核生物中的谷氨酰胺合成酶都是由两个亚基组成的。

这两个亚基分别是主亚基和辅助亚基，主要区别在于辅助亚基能够稳定主亚基的三维结构并且参与反应过程。

此外，研究人员还通过X射线晶体学等技术对谷氨酰胺合成酶进行深入研究，揭示了其结构和催化方式，并且发现谷氨酰胺合成酶还能够参与到细胞的其他代谢途径中。

三、谷氨酰胺合成酶的功能调控机制细胞通过一系列机制来调节谷氨酰胺合成酶的活性，其中包括酶的翻译后修饰、合成酶的配体结合和合成酶的转录和翻译等机制。

此外，在有些细胞中，谷氨酰胺合成酶的活性也能够被外部信号所影响，如温度、pH值、外源化学物质等。

植物乳杆菌Lp-G18谷氨酰胺合成酶活力发酵工艺优化徐煜;蒋德意;韩迪【摘要】植物乳杆菌是一种具有多种生物活性的益生菌,其中缓解肌肉疲劳和损伤能力的运动保健功能引起了市场的关注,这与其谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)的活力相关,目前尚缺乏对植物乳杆菌GS发酵工艺研究的报道.通过在培养基中添加L-谷氨酸、调整碳源以及改变金属离子质量浓度等方式提高植物乳杆菌Lp-G18发酵后的GS活力.得到优化培养基组成为:葡萄糖40 g/L(222 mmol/L)、七水硫酸镁4.92 g/L(20 mmol/L)、一水硫酸锰0.025 g/L、L-谷氨酸8.82 g/L(60 mmol/L)、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸氢二胺2 g/L、乙酸钠5 g/L、吐温-801 g/L.采用优化培养基发酵得到的GS活力比原基础MRS培养基培养条件下的酶活力提高了1.4倍.【期刊名称】《乳业科学与技术》【年(卷),期】2019(042)002【总页数】5页(P13-17)【关键词】植物乳杆菌;谷氨酰胺;合成酶活力;发酵【作者】徐煜;蒋德意;韩迪【作者单位】润盈生物工程(上海)有限公司,上海 200436;润盈生物工程(上海)有限公司,上海 200436;润盈生物工程(上海)有限公司,上海 200436【正文语种】中文【中图分类】TS252.1乳杆菌是一类传统的、普遍被认为安全的益生菌，在酸乳、饮料、菌粉或泡菜中都有使用[1] 。

植物乳杆菌是常见的益生菌之一，具有良好的耐酸、耐胆盐能力，并具有许多益生功能，如调节肠道健康、抗氧化、抗真菌、预防便秘和腹泻、防治上呼吸道感染、抑制致病菌侵入和调节人体免疫等作用[2] 。

同时，植物乳杆菌还具有运动保健功能，具有缓解肌肉疲劳和损伤的能力[3] 。

植物乳杆菌缓解肌肉疲劳及损伤的能力与其谷氨酰胺的合成能力相关。

提取方法2：Zhang CF, Peng SB, Peng XX, Chavez AQ,Bennett J. Response of glutamine synthetase isoforms to nitrogen sources in rice Oryza Sativa.L roots.Plant Sci,1997,125:163-170Rhodes D, Rendo GA, Stewart GR. The control of glutamine synthetase level in Lemna minor L. Planta, 1975, 125:201-211The reaction mixture (3.0 ml) consistedof sodium ketoglutarate (10_mol), ammonium chloride(10_mol), calcium chloride (10_mol), NADH (2_mol), Tris–HClbuffer (100_mol, pH 8.2) and enzyme 0.1 ml.Following a 30 min incubation period at 30◦C in 20μmol MgSO4, 80μmol α-ketoglutarate, 6μmol hydroxylamine, 8μmol ATP and enzyme extract, the enzymatic reaction was terminated by the addition of 1.5 ml of a solution containing 0.37mol/l FeCl3, 0.2 mol/l TCA and 0.37 mol/l HCl andthe amount of glutamyl hydroxamate determined at 540 nm.Lea P J, Blackwell R D, Chen F L. Enzymes of primary metabolism. In: Harborne J B.Methods in Plant Biochemistry. Vol.3. New York: Academic Press, 1990. pp 260-273the reaction mixture (3 ml) consisted of 5μmo l α-ketoglutarate, 1μmol potassium chloride, 48.75μmol Tris–HCl buffer (pH 7.6), 0.6μmol NADH, 0.3 ml enzyme and 8μmol L-glutamine300μmol Tris–HCl buffer (pH 8.0), 600μmol ammonium chloride, 3μmol calcium chloride, 0.6μmol NADH, and 0.1 ml enzyme. The change of absorption value was detected at 340 nm in 3 min,Singh RD, Srivastava H S. Increase in glutamate synthase (NADH) activity in maize seedlings in response to nitrate and ammonium nitrogen. Physiol. Plant, 1986, 66:413-416Loulakakis KA, Roubelakis-Angelakis KA. Intracellular localization and properties of NADH–glutamate dehydrogenase form Vitis vinifera L.: Purification and characterization of the major leaf isoenzyme.Journal of Experimental Botany, 1990, 41:1223-1230EP酶活性的测定高玲, 叶茂炳‘ 张荣铣“ 徐朗莱, 小麦旗叶老化期间的内肤酶植物生理学报,1998,24（2）183-188硝酸还原酶活性的测定：仪器：离心机；分光光度计；冰箱；研钵；试管等试剂：亚硝酸钠；Na2HPO4·12H2O；NaH2PO4·2H2O；磺胺；浓盐酸；萘基乙烯胺；KNO3K2HPO4·3H2O；半胱氨酸；EDTA；NADH（辅酶Ⅰ）；李合生主编，植物生理生化实验原理和技术，高等教育出版社，2000,125-127 Li H-S(李合生). Experimental Principle and Technique for Plant Physiology and Biochemistry (植物生理生化实验原理和技术).Beijing: Higher Education Press, 2000. pp 125-127 (in Chinese)关于您问的“磷酸缓冲液里该加多少EDTA和半胱氨酸，均没有说明”在此书的P126页写的很全面，步骤也非常详细，请查阅，如：提取缓冲液。

货号：MS1801 规格：100管/96样谷氨酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAT）试剂盒说明书微量法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：GOGAT广泛分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同构成GS/GOGAT循环，参与氨同化的调控。

测定原理：GOGAT催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸；同时NADH氧化生成NAD+，340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。

自备实验用品及仪器：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存；粗酶液提取：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。

8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（1）在试剂二中加入9mL试剂一充分溶解混匀，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用（配好后3h内用完）；（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL试剂二，混匀，立即记录340nm 处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

植物来源谷氨酰胺转氨酶的研究进展李洪波;李金;张天琪;李红娟;于景华【摘要】植物来源谷氨酰胺转氨酶(TGase)是—种在植物中广泛存在的催化酰基转移反应的蛋白酶,已被证实具有不同的理化性质和生理功能.结合最新的研究,本文综述了植物来源TGase在不同组织、器官中的分布,性质及其在植物生长发育过程中起到的作用.同时,为了获得植物来源TGase进行功能特性及其在食品、医学和其它工业中的应用研究,本文介绍了植物来源TGase异源表达的研究进展,并为该方法的改进提出了建设性意见.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)016【总页数】5页(P336-339,345)【关键词】植物源 TGase;功能特性;异源表达;展望【作者】李洪波;李金;张天琪;李红娟;于景华【作者单位】天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457【正文语种】中文【中图分类】TS201.3谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,TGase,EC 2.3.2.13)是一种催化酰基转移反应的酶,它能通过谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基(氨基受体)和赖氨酸残基的ε-氨基或其它伯胺基(氨基供体)之间的酰基转移反应形成ε-(γ-谷氨基)赖氨酸异肽键,从而实现蛋白质分子内、分子间的交联[1]。

TGase的交联作用可以改善蛋白质的理化性质,进而影响其功能特性。

TGase在食品、生物医学、纺织等方面有着广阔的应用前景,其中食品行业的应用最受关注,这也进一步增加了对廉价、有效和安全TGase的需求[2-3]。

根据其来源不同,谷氨酰胺转氨酶大致分为以下三类:动物来源的谷氨酰胺转氨酶、植物来源的谷氨酰胺转氨酶和微生物来源的谷氨酰胺转氨酶(MTG)。

谷氨酰胺合成途径的研究和应用谷氨酰胺是一种重要的氨基酸，在生物体内发挥着重要的生理功能。

它在蛋白质合成中起到非常重要的作用，在蛋白质代谢中具有不可替代的作用。

谷氨酰胺也具有保肝、降压、抗抑郁、增强免疫功能等作用。

因此，谷氨酰胺的合成途径的研究和应用具有重要的意义。

一、谷氨酰胺的合成途径1、谷氨酸转化合成谷氨酰胺：谷氨酸转化合成谷氨酰胺是主要的合成途径，其催化反应是由谷氨酸合成酶催化，需消耗一个ATP，同时，还需要谷氨酰胺转移到丙酮酸上，生成丙酮酸谷氨酰胺。

2、磷酸化：磷酸化也是谷氨酰胺的合成途径之一。

蛋白质组分中含Arg磷酸化，同时，Arg磷酸化还可通过PIP2激活钙络合物的合成来进行触发。

3、二氢氨基酸和谷氨酸合成谷氨酰胺：二氢氨基酸和谷氨酸合成谷氨酰胺也是一种合成途径，它是一种非酶催化的反应，它可以直接在细胞中进行。

二、谷氨酰胺合成途径的应用谷氨酰胺在医学和营养学领域中有很重要的应用。

1、肝功能保护：谷氨酰胺能够通过降低血浆氨基酸浓度，促进谷氨酸转移酶的活力，从而降低血浆和组织中谷氨酸的浓度，保护肝功能。

2、营养补充：谷氨酰胺具有优良的营养特别是肝脏不良的患者，谷氨酰胺能增加肝脏细胞的活力，提高肝脏代谢的能力。

3、美容瘦身：谷氨酰胺可以调节身体的代谢，并且可以对皮肤美容和减肥有所帮助。

三、谷氨酰胺合成途径研究的进展目前，关于谷氨酰胺合成途径的研究已经进展到了许多新的领域。

1、基因治疗：由于谷氨酰胺在基因表达中起到重要作用，目前基因治疗已成为科学研究的新方向。

2、靶向化学：针对谷氨酰胺合成途径的催化反应进行靶向化学设计，可用于开发针对谷氨酰胺的新抗肿瘤药物。

3、代谢组学：代谢组学已成为当前研究谷氨酰胺合成途径的热点，可以通过代谢组学技术来研究谷氨酰胺与人体健康的关系。

总之，谷氨酰胺合成途径的研究和应用已经广泛涉及医学、营养学等领域，未来的研究将更多的关注到基因治疗、靶向化学和代谢组学等领域，为谷氨酰胺的发现和应用打下更加坚实的基础。