微生物检验
- 格式：doc
- 大小：1.28 MB
- 文档页数：26
金黄色葡萄球菌检验
一、金黄色葡萄球菌概述
1、菌体形态学(葡萄串状排列的G＋小球菌)
(1)形态大小：典型的葡萄球菌呈球形，直径0.4-1.2μm，无鞭毛及芽胞，少有荚膜
(2)排列：固体培养物：葡萄串状排列
液体培养物或脓汁：双球或短链状排列
(3)染色： G＋，当衰老、死亡或对青霉素有抗药性的菌株也为G－ 。
(4)培养特性
①营养要求:不高，需氧或兼性厌氧
②耐盐性很强：在含100－150g／L的氯化钠培养基中能生长
③产 毒 素:在含有20％-30％二氧化碳的环境中培养，可产生大量的毒素。
④在肉汤培养基中生长迅速，37℃，24h培养后，呈均匀混浊生长，延长培养时间，管底出现少量沉淀，轻轻振摇，沉淀物上升，旋即消散，培养2-3 d后可形成很薄的菌环，在管底则形成多量粘稠沉淀。
⑤菌落特点：在普通营养琼脂平板上培养24-48 h形成不透明的、具有脂溶性金黄色色素（其它葡萄球菌可形成白色、柠檬色、粉色等）的s型菌落.
促进颜色生成：*37℃.22℃各培养1－2d，色素产生明显。
*培养基中含有碳水化合物、牛乳或血清等，色素形成最好；
*有氧及二氧化碳环境下易形成色素
⑥溶血毒素：多数致病性菌株在血琼脂平板上形成较大的菌落，可产生溶血毒素而出现β－溶血菌落。
2、 葡萄球菌分类
葡萄球菌种类繁多
*早期依菌落色素分类：
金黄色葡萄球菌
白色葡萄球菌
柠檬色葡萄球菌
还有其他染色
*《伯杰氏鉴定细菌学手册》(第八版)按葡萄球菌的生理化学组成分：
*金黄色葡萄球菌：多为致病性菌.
表皮葡萄球菌：偶尔致病
腐生葡萄球菌：非致病菌
*引起食物中毒的是产耐热肠毒素金黄色葡萄球菌
*金黄色葡萄球菌分型
耐热肠毒素分型：A、B、C、D、E、F、G和I 八型
噬菌体分型：已分Ⅰ--Ⅴ五群，26型。
血清分型：有30多种
抗生素分型：流行病学追踪
质粒分型：我国没应用
3、 金黄色葡萄球菌分布广、数量多
金黄色葡萄球菌在自然界广泛分布的主要原因是 ①来源广 数量多：源自带菌的动物和人
②抵抗力强 易存活：对紫外线、干燥、盐等都有较强耐受力，是不形成芽胞的细菌中的最强者之一，但煮沸能迅速杀死该菌。
③体积小 易扩散：该菌体积小，易随风尘土等扩散
④营养要求不高，易于生长。
金黄色葡萄球菌是世界上广泛存在的引起食物中毒的最主要菌种之一。
4、致病性
（1）致人类患病的：主要是金黄色葡萄球菌
（2）金黄色葡萄球菌可引起化脓性感染、全身感染、食物中毒
化脓性感染:毛囊炎、疖、痈、伤口化脓、气管炎、肺炎、 中耳炎、脑膜炎、心包炎等
全身感染:如败血症、脓毒血症等
食物中毒：主要是产耐热肠毒素金黄色葡萄球菌污染食物所致。
*引起食物中毒的金黄色葡萄球菌:
①是世界上广泛存在的引起食物中毒的最主要菌种之一。
②在一般污染食物和室温下4—8h以上可产生毒素；
③在含有20％-30％二氧化碳的环境中培养，可产生大量的毒素。
④引起中毒的主要污染食品：
奶、肉、蛋、鱼类及其制品等各种动物性食品。剩饭、糯米凉糕、凉粉和米酒等。
* 淀粉和动物性食品混和可促进毒素的形成
⑤毒素与酶
葡萄球菌产生的毒素和酶的能力决定其的致病力。
致病菌株产生的毒素和酶主要有下列几种：
a.溶血毒素——β－溶血
b.杀白血球毒素——化脓
*c.肠毒素——食物中毒的胃肠炎
*d.血浆凝固酶——致病性SCA菌的鉴别指标+
e.溶纤维蛋白酶
f.透明质酸酶——扩散因子 致病
g.脱氧核糖核酸酶
解释 h.其他：蛋白酶、卵磷脂酶，核酸酶等
d.血浆凝固酶－鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标
这是一种能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的兔或人血浆发生凝固的酶。
大多数致病性葡萄球菌产生此酶，而非致病性菌一般不产生。因此，凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。
凝固酶较耐热，加热至100℃经30min或高压消毒后仍保存部分活性，但易被蛋白分解酶破坏。
e.溶纤维蛋白酶
*能使人、犬、豚鼠及家兔的已经凝固的纤维蛋白溶解。
溶纤维蛋白酶是一种激酶，可激活血浆蛋白酶原成为血浆蛋白酶而使纤维蛋白溶解。
溶纤维蛋白酶--激活血浆蛋白酶原--血浆蛋白酶--纤维蛋白溶解
*凝固酶及溶纤维蛋白酶可同时测定:在含有血浆的琼脂平板内,初期培养后，菌落周围若出现一个不透明圈，表示产生凝固酶；继续培养时，不透明圈消失，说明为溶纤维蛋白酶作用的结果。
f.透 明 质酸酶
利于细菌在组织中的扩散
g.脱氧核糖核酸酶
有人认为脱氧核糖核酸酶是鉴定葡萄球菌毒力的又一指标。
5 生化特性
总结:金葡菌污染源多、抵抗力强、个体小·，分布广；
耐盐性很强 ；
血浆凝固酶有无是判定该菌有无致病性的重要指标；
金葡菌肠毒素耐热100 ℃ 2h；
多种动物性、植物性，特别是混合性食物易污染。
金葡菌肠毒素引起的食物中毒在世界范围都很重要
二、国标金黄色葡萄球菌检验
菌落溶血分类特征:
①α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；
②β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；
③γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。
检测血浆凝固酶:
1.用试管法：放检测处
a. 挑取Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mL BHI 和营养琼脂斜面，36℃±l℃ 培养18h－24h。
b. 取新鲜配制兔血浆0.5 mL ，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL－0.3 mL，振荡摇匀，置36℃±1℃ 温箱或水浴箱内，每0.5h观察一次，观察6h ，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。
c.同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 2.玻片法(快，但不是标准方法)
(1）取生理盐水两滴，分别置于载玻片的两端。
(2）以无菌接种环分别挑取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌斜面培养物少许，分别置于载玻片上的生理盐水内，制成均匀的细菌悬液，观察有无自凝现象。
(3)若无自凝现象，则于每滴悬液内分别加入兔血浆各一滴，混匀。1－2min内如出现颗粒状的凝集现象，即为阳性；若不出现凝集，则为阴性。
原理说明
1）增菌培养法
－－致病性金黄色葡萄球菌具以下特点：
（1）－－耐盐性强
（2）－－可产生溶血素
（3）－－可产生卵磷脂酶
（4）－－可产生凝固酶，是鉴定致病性金黄 色葡萄球菌的重要指标
2) 检测方法：
（1）金黄色葡萄球菌耐盐性强检测：
在100－150g／L 的氯化钠培养基中能生长，适宜生长的盐浓度为5.0％—7.5％，可以利用这个特性对金黄色葡萄球菌增菌，抑制杂菌。
(2）金黄色葡萄球菌可产生溶血素的检测：
（3）金黄色葡萄球菌在Baird—Parker(含卵黄和亚碲酸钾和高盐)平板上生长，菌落为黑色，周围有一混浊带，在其外层有一透明圈，利用此特性可分离金黄色葡萄球菌。
**（4）金黄色葡萄球菌可产生凝固酶的检验
凝固酶可使血浆中的血浆蛋白凝固，这是“鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标” 。
有试管法（标准方法）和玻片法（快）
新鲜兔血浆0.5ml+金黄色葡萄球菌18-24h BHI培养物0.2-0.3ml。混匀，36℃培养，每0.5h观察1次共观察6h，记录结果。
附录B (规范性附录)
葡萄球菌肠毒素检验
金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins，SE)是一系列由金黄色葡萄球菌分泌的外毒素可溶性蛋白质。
SE的分型：目前明确的SE血清型有8型：A、B、C、D、E、G、H和I。SEC根据抗原性不同又分为SEC1、C2和C3三个亚型
SE的成分：SE属单肽链可溶性蛋白，分子量27-30kDa。
SE的特点：有四个共同特点：
①致病性强*，引起呕吐和胃肠炎；
②超抗原性*；
③对加热*和胃蛋白酶有抵抗性；
④相似的三级结构。
致病性强：SE是金黄色葡萄球菌食物中毒 (Staphylococcal food poison，SFP) --急性胃肠炎的主要致病因子，还参与脓毒血症引起的多器官功能衰竭(Multi-organ failure，MOF)的发生、发展过程。
SE是生物战剂： SE毒性高、稳定性好、制备简单，是一类良好的生物战剂。
SE最独特的特点是超抗原性:超抗原(Superantigen，SAg)指具有丝分裂原（motigen）作用，可与淋巴细胞表面相应受体结合，能够多克隆刺激淋巴细胞发生有丝分裂并使细胞增殖。
耐热性： SE经100℃煮沸30min不被破坏，煮沸2 h失活；也不受胰蛋白酶的影响。
酶链免疫法（ELISA）的双抗体夹心法检测金黄色葡萄球菌肠毒素
ELISA双抗体夹心法的基本原理： S P
Ab+Ag（?肠毒素）+Ab*＋底物－－带色产物－－测定
书上称“二抗”不合适
思考 复习题
1、金黄色葡萄球菌在自然界广泛存在的主要原因是广泛源自动物和人的分泌物和排泄物、
体积较小、营养要求不高和 抵抗力较强 。
2、金黄色葡萄球菌的固体培养物呈葡萄串状排列，而液体培养物则常呈双球或短链状排列。金黄色葡萄球菌为革兰氏染色 阳 性 ，当衰老、死亡或对青霉素有抗药性的菌株则为革兰氏 阴 性。
3 、金葡菌的耐盐性很强，在含100－150 g／L（最适为50－75 g／L ） 的氯化钠培养基中能生长； 在含有20％-30％二氧化碳的环境中 培养，可产生大量的耐热肠毒素。
4、肠毒素是某些金葡菌菌株产生一种可溶性蛋白质，可耐热煮沸 2h方失活，也不受胰蛋白酶的影响。可使人引起急性胃肠炎症状，是引起食物中毒的主要因子。
5、血浆凝固酶和热稳定核酸酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。
6、给出Baird-Parker琼脂的配方，试述金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板长出菌落的特点及其原因？
7、自学－－理解和掌握金黄色葡萄球菌计数的2个公式，并会应用。
Sensing SurfaceAntigenEnzyme-labeled
antibodyAntibodySensing SurfaceAntigenEnzyme-labeled
