酶工程期末考核论文
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摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域。本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术) 及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,并对固定化酶技术的应用前景进行了展望。
关键词：固定化酶；制备；应用；磁性载体；定向固定
固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。下面从传统固定化技术、传统固定化技术的改进、新型固定化技术等三个方面来概述一下酶固定化方法的研究进展：
现代食品科技 Ｍｏｄｅｒｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１３，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．１２ 含环氧基固定化葡萄糖氧化酶共聚载体的 催化性能研究 李丕武，李瑞瑞，刘佃磊，郝琼，杨晴，王升 （齐鲁工业大学食品与生物工程学院，山东济南２５０３５ ３） 摘要：环氧基团可以在温和条件下与酶分子的氨基发生共价结合使其固定于载体表面。选用含有活性环氧基团的甲基丙烯酸缩 水甘油酯（ＧＭＡ）为单体，Ｎ＇Ｎ 一亚甲基双丙烯￣－（ＭＢＡＡ）为交联剂，聚乙烯吡咯烷酮（ｅｖＰ）为稳定剂，２，２ －偶氮二异丁腈（ＡｍＮ）为引 发剂，乙醇水溶液为分散介质，并加入Ｆｅ ０４磁流体，通过反相悬浮聚合成功合成了大孔Ｆｅ＝ｏｆｌｕｉｄ－ＧＭＡ．ＭＢＡＡ共聚物载体（ＦＧＭ）。 通过调节磁流体和交联剂用量，可调节载体比表面积，孔径以及溶胀性能。将葡萄糖氧化酶（ＧｏＤ）偶联于ＧＭＡ含量２０％，磁流体含量 ４％，交联剂含量４０％的共聚物载体４ＦＧＭ（４０），制成固定化葡萄糖氧化酶，其表观酶活高达５４６．２３￣２．３３Ｕ／ｇ。讨论了固定化葡萄糖氧 化酶的酶学｝生质，在最适条件（５５℃，ｐＨ ８．０）下，固定化酶的表观酶活回收率为９０．４５％；连续使用１５次活性仍接近初始值的６０％； 固定化酶在４℃保存３０ ｄ，活性保持不变。 关键词：环氧基；反相悬浮聚合；固定化酶；葡萄糖氧化酶 文章篇号：１６７３．９０７８（２０１３）１２—２９２６．２９３０ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔｅｒ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｏｘｉｒａｎｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｇｌｕｅｏｓｅ ０ｘｉｄａｓｅＩｏｒ １ ｌ ＬＩ Ｐｉ－ｗｕ，ＬＩ Ｒｕｉ－ｒｕｉ，ＬＩＵ Ｄｉａｎ－ｌｅｉ，ＨＡＯ Ｑｉｏｎｇ，ＹＡＮＧ Ｑｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｓｈｅｎｇ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＦｏｏｄ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｑｉｌｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉｎａｎ ２５０３５３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｘｉｒａｎｅ ｇｒｏｕｐｓ ｃａｒｌ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｕｎｄｅｒ ｍｉｌｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ＳＯ ｔｈａｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｅｒ．Ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ｆｅ￣ｏｆｌｕｉｄ—ＧＭＡ－ＭＢＡＡ（ＦＧＭ）ｐｏｌｙｍｅｒ ｗｅｒｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ ｍｖｅ￣ｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｉｄｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ（ＧＭＡ）ａｓ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｎｏｍｅｒ ａｎｄ Ｎ，Ｎ＇－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ—ｂｉｓ—ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｆＭＢＡＡ）ａｓ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ—ｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ． Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＰＶＰ）ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ ｍｏｎｏｍｅｒ ａｎｄ ａｚｏｄｉｉｓｏｂｕｔｙｒｏｎｉｔｒｉｌｅ（ＡＩＢＮ）ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｍｏｎｏｍｅｒ．Ｆｅ３０４Ｗａｓ ａｄｄｅｄ ａｓ ｍａｇｎｅｔｏｆｌｕｉｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ，ｅｔｈａｎｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｏｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｐｐａｒｅｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｏｆａｐｐａｒｅｎｔ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ９０．４５％ （ａｂｏｕｔ ５４６．２３￣２．３３ Ｕ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ（ＧＯＤ）ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ＦＧＭ ｐｏｌｙｍｅｒ［ｗ（ＧＭＡ）＝２０％，Ｗ （ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ）＝Ｏ．４％，ｗ（ＭＢＡＡ）＝４０％］ａｔ ５５℃ａｎｄ ｐＨ ８．０．Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｎｅａｒｌｙ ６０％ｏｆｉｔｓ ｉｎｉｔｉａｌ ｅｖｅｎ ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｕｓｅｄ ｆｏｒ １５ ｔｉｍｅｓ．Ａｆｔｅｒ ａ ３０一ｄａｙ ｓｔｏｒａｇｅ ａｔ ４℃．ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｓｈｏｗｅｄ ｌｉｔｔｌｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｏｘｉｒａｎｅ；ｉｎｖｅｒｓｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ；ｉｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ；ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ 葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ）是一种氧化还原酶，在 Ｏ２充足条件下，它能够快速专一地催化Ｂ—Ｄ一葡萄糖为 Ｄ—Ｄ．葡萄糖酸和Ｈ２Ｏ２【ｌ Ｊ，它广泛应用于食品、医药和 饲料行业，起到了去除葡萄糖、脱氢、杀菌的作用【２］。 而要实现该酶的工业化应用，酶的固定化技术是关键。 酶在固定化状态下可保证其高级结构和活性中心的氨 基酸残基不因高温、强酸、强碱等发生变化［３］。因此， 研制一种性能优异、价格合理的固定化载体和高活性、 收稿日期：２０１３．０７—３０ 基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２１５０４） 作者简介：李丕武（１９７０－），男，博士，教授，研究方向：微生物酶技术 高稳定性的固定化葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ）是本文的主要 内容。 一般采用吸附、共价偶联、交联和包埋４种固定 化方法来提高酶对环境的适应能力和重复利用性能。 其中共价偶联法是将酶的非活性侧链基团与载体的活 性官能团共价结合，固定化后的酶具备优良的稳定性， 是目前研究最活跃的固定化方法 。研究表明，环氧 基具有很高的反应活性和可塑性，载体上的环氧基可 在温和条件下直接与酶分子上的－ＮＨ２，一ＨＳ等非活性 基团进行共价固定；也可通过双官能团化合物为交联 剂进行连接。另外，对于一些含有多种非活性基团酶，
■四磨
酶固定化技术的研究进展
王 宇 （信阳职业技术学院应用化学与环境工程学院，河南信阳４６４０００）
【摘要】目前，在很多领域内都开始应用固定化酶，这是因 为固定化酶有着很多的优点，特别是稳定性和可重复使用性 等。固定化酶技术涉及到多个学科，经过多年的发展，已经日趋 成熟，随着生物技术的不断发展，固定化酶的应用范围将会越 来越广。本文主要介绍酶固定化技术的研究进展，希望可以提 供一些有价值的参考意见。 【关键词】酶固定化研究进展分析
蛋白质是酶的化学本质，其具有一系列的优点，比如十分 环保，不会对环境造成污染，并且有着较高的选择性催化作用 和催化活性等等；但是，游离状态的酶对很多物质却有着较差 的稳定性，比如热、强酸、强碱、有机溶剂和高离子强度等，容易 失活，并且反应之后容易混入一些其他的物质，比如催化产物 等等，很难进行纯化。为了解决这个问题，在２０世纪出现了酶固 定化技术，并且得到了快速的发展［】】。酶固定化技术指的是采用 人工的方法，将从生物体内提取出来的酶在载体上进行固定。 因为化学或者物理方法限制了固定化酶的运动，那么就可以从 反应递质中回收固定化酶，所以，在原则上，酶指的是那些可以 进行批量操作的，或者是可以在连续操作中重复使用的。 １ 传统的酶固定化方法 传统的酶固定化方法主要包括四个类型，分别是吸附法、 交联法、包埋法和共价结合法。最早出现的是吸附法，吸附法又 可以分为两种，分别是离子交换吸附和物理吸附。这种方法条 件比较温和，基本上不会很大程度地改变酶的构象，因此对酶 的催化性就不会产生大的影响；但是酶和载体之间却有着比较 弱的结合力，这样在一些特殊的条件下，比如有着较高的盐浓 度、高温等，酶就很容易从载体上脱落并且污染催化反应产物。 交联法指的是利用一些多功能交联试剂，让共价键存在于 酶分子和交联试剂之间，将不同的材料添加于交联体系中，再 加上一些不同的交联条件，从而产生固定化酶。交联法往往不 会独立存在，通常作为其他固定化方法的辅助手段。 包埋法指的是混合载体和酶溶液，加入一些引发剂，使其 产生聚合反应，通过物理作用，在载体的网格中限定酶，从而实 现酶固定化的方法。这种方法反应条件温和，不会对酶的构象 产生影响，因此有着比较高的酶活力回收率。但是采用这种方 法容易出现漏失和扩散限制等问题，传质阻力也会影响到催化 反应，因此在应用方面会有局限。 载体偶联法指的是载体表面的活性功能基团和酶分子的 非必需基团形成化学共价键，从而实现不可逆结合的酶固定方 法，也被称之为共价结合法。采用这种方法可以牢固地连接载 作者简介：王宇，男，本科，讲师。 体和固定化酶，稳定性和重复使用性较好，因此，目前应用比较 广泛。但是，这种方法有着剧烈的反应，会严重损失固定化酶的 活性。 ２新型酶固定化方法 在开发新型酶固定化方法时，需要遵循以下原则：在进行 酶的固定化时，需要在比较温和的条件下实现，并且在酶活力 损失方面，也需要最大限度地减少，甚至避免。在制备高活性固 定化酶时，可以采用很多的新方法，比如辐射、光、电子以及等 离子体等。ｔＷＣｓ为辐射源，利用射线在尼龙膜表面共聚甲基丙 烯酸甲酯接枝，进一步活化，就可以固定青霉素酚化酶。光偶联 法是获得具有较高活力固定化酶的一种方法，其是使用光敏性 单体聚合物包埋具有光敏基团载体的共价固定化酶或者普通 的固定化酶，在温和的条件下实现转化，因此获得的固定化酶 往往有着比较高的酶活力。“等利用含芳香叠氮基的光活性 酯，经过远紫外光的辐照，叠氮基就可以光解生成氮烯，然后就 会与ＰＥＳ膜表面的ｃ—Ｈ键间发生插入反应，生成仲胺，然后在 ＰＥＳ膜的表面合成酶共价键。等离子体是一个聚集体，其含有 很多的高度激发原子、分子和离子等，在常温下存在着大量的 等离子体。等离子体可以自由修饰载体材料表面，从而实现活 性基团引入的目的。Ｐｕｌｅｏ等将钛合金Ｔｉ一６Ａ ｖ表面用丙烯 酸铵等离子体处理引入氨基，然后在钛合金表面接枝含碳硝化 甘油，或者先用琥珀酸酐处理经等离子体处理的钛合金，然后 再进行接枝，采用的依然是含碳硝化甘油，这样就可以固定溶 茵酶和骨形态蛋白，从而实现在生物惰性金属上固定生物分子 的目的。 ３酶的定向固定化及多酶共固技术 传统的酶固定化方法有一个非常大的缺点就是在连接载 体的时候，可以在酶的任意位点进行，这样就不能有效地暴露 酶活性位点，并且还会降低酶的固定化量。因此，在近一段时期 的固定化酶研究中，非常关键的一个方面就是定向固定化酶技 术。有些专家利用适当的多克隆抗体，在无孔羟烷基异丁酸酯 的改良微球上固定了胰凝乳蛋白酶，这样可以对在扩散作用 下，胰凝乳蛋白酶对蛋白水解的动力学限制进行消除。有专家 在定向固定半乳糖氧化酶时，采用的是高碘酸钠活化半乳糖氧 化酶的糖链，然后结合活化的糖链来实现这个目的。因为大分 子底物与酶的活性位点比较接近，其可以有效地改善催化动力 学参数。为了将不同酶的优势充分地发挥出来，可以结合来源 不同的酶和整个细胞的生物催化性能，固定化多酶或者是整个 细胞，这方面也受到了越来越多研究者的关注。有专家在乳胶 膜上固定了葡萄糖昔酶和葡萄糖氧化酶，然后就可以将这个乳 胶膜应用于生态友好酶乳胶膜反应器。 （下转第３１０９页） 基层医学论坛２０１３年８月第ｌ７卷第２３期 ３１０Ｓ
第３３卷第１期 ２００８年３月 广州化学 Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏ１．３３，Ｎｏ．１ Ｍａｒ，２００８
非水相中固定化脂肪酶催化性能的研究
虞英，蒋惠亮
（江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡２１４１２２）
摘要：以离子交换树脂为载体，用离子交换吸附法固定化脂肪酶，对影响固定化过程的各种因 素进行了考察，确定了最优条件。得到的固定化酶催化合成月桂酸月桂醇酯，考查了在不同ｌｅｅ 值有机溶剂中的催化反应，异辛烷为最佳反应介质，最佳水含量为８％，最佳酸醇摩尔比为１：２， 最适催化温度为５５℃，得到的活化能Ｅａ为ｌ９．Ｏ０ ｋＪ／ｍｏｌ。 关键词：脂肪酶；固定化；离子交换树脂；酯催化 中图分类号：ＴＱ４２６．９７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９．２２０Ｘ（２００８）０１．０００１．０５
近年来，随着绿色化学的兴起和对节能、环保的重视，有机相酶催化在有机合成中的应 用越来越受到人们的青睐。
非水相中酶催化的研究不仅为酶学研究注入了新的活力，而且拓宽了酶的应用范围和领
域。但由于酶在溶剂中不溶解，反应过程中易团聚，大大降低了酶的可利用率。如果将酶固 定化在惰性载体上，则可以提高酶在溶剂中的扩散效果和热力学稳定性，调节和控制酶的活
性与选择性，有利于酶的回收和连续化反应【ｌ一。
脂肪酶被广泛用于食品，制药工业和精细化工中。利用脂肪酶在有机相催化的各种反应
可以合成许多高附加值产品 ．４】。
一些研究表明，脂肪酶的固定化提高了其在有机溶剂中的反应活力以及热稳定性和化学 稳定性 Ｊ。脂肪酶的固定化有多种【８】，由于酶在有机溶剂中不同于在水中，不存在脱落流
失问题，又因物理吸附成本低且简单、容易保持酶的特异性等特点而受到重视。 本实验以离子交换树脂为载体，用离子交换吸附法固定脂肪酶。研究了酶的固定化条件，
考察了不同有机溶剂中的催化反应及酶的最适温度，并对该酶的动力学特性进行了分析。
ｌ材料与方法
