3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定还原糖
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3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定还原糖
一.原理
3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物,再一定范围内,还原糖的量与反应液的颜色强度成比例关系,利用比色法可测知样品的含糖量。
次法是半微量定糖法,操作简便、快速,杂质干扰较少,是一种很好的糖定量测定方法。二.试剂
1. 3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)
甲液-溶解6.9克结晶酚(苯酚)于15.2毫升10%氢氧化钠中,并稀释至69毫升,再此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。
乙液-称取255克酒石酸甲钠,加到300毫升10%氢氧化钠中,再加入880毫升1%3,5-二硝基水杨酸溶液。
将甲液和乙液相混合即得黄色试剂,保存于棕色试剂瓶中,在室温下放置7-10天后使用。
2.0.1%葡萄糖标准液
准确称取100毫克分析纯的葡萄糖(预先在105℃干燥至恒重),用少量蒸馏水溶解后定容至100毫升,保存于冰箱备用。
三.制作标准曲线
取9支大试管,分别按表一顺序加入各种试剂。
表一
将上述各管溶液混后,在紫外可见分光光度计上用绿色滤光片(520nm) 进行比色测定,用空白管溶液调零,记录光密度值。以光密度值为横坐标,以葡萄糖浓度为纵坐标,绘制标准曲线。
四.定糖
根据所取样品的个数来确定所需的试管数,在这里以7支试管为例,分别按表二顺序来加入各种试剂。
将各管混匀后,按制作标准曲线时的同样方法的操作,测定各管的光密度,在标准曲线上查出相应的还原糖含量,按下述公式计算出还原糖含量。
还原糖%= (还原糖毫克数⨯样品稀释倍数)/培养基中总含糖量⨯100
表二