Western 印迹法检测蛋白质.ppt

WB的基本步骤
蛋白质样品的制备 蛋白质的SDS-PAGE电泳 蛋白质的膜转移 封闭与抗原抗体反应 目标蛋白检测
Overview of sample types in the biomarker development
组织样本制备
处死动物
取相应 肝脏组织
-80度冻存 避免反复冻融
转印膜选择
转膜确认
丽春红S的使用 Prestain ™蛋白质预染
Markers
Western Blot一般流程
• 蛋白样品的制备 • SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
封闭
什么叫封闭？ 加入抗体前需要将膜在封闭剂里进行封闭
为什么要封闭？ 封闭膜上的非特异性结合位点，封闭后，可以减少后续 的一抗或二抗与膜的非特异性结合，降低背景着色，提 高信噪比。 采用什么封闭？ 商业化封闭液，5%脱脂奶粉等
• Bradford法 • Lowry法 • BCA法
Western Blot一般流程
• 蛋白样品的制备 • SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
凝胶成份
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液
为什么要做WB？
目标蛋白检测
目标蛋白定性定量
多目标同时检测
Marker+靶蛋白 对照（or上样量校正蛋白）+靶蛋白 总蛋白+修饰化蛋白 靶蛋白+靶蛋白 核酸+结合蛋白
双色－EMSA
700 and 800 Overlay
DNA-Protein Complex Unbound DNA IRDye 800 Unbound DNA IRDye 700

比色法-BCA法
✓ BCA （Bicinchoninic acid) 试剂的主要成分为二喹啉 甲酸钠。 ✓ BCA并不能直接与蛋白质发生化学或是物理上的反应， 而是对双缩脲反应的强化。BCA 极易与 Cu+结合形成紫 色的复合物，该复合物在 562 nm 处有最大吸收峰，对 入射光的吸收程度与 Cu+的浓度成正比。
凯氏定氮法由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测 定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量。
蛋白质含量＝含氮量 Х 6.25 此方法的测定范围为0.2～1.0 mg氮。 ✓ 优点：应用范围广，重现性好、准确度高 ✓ 缺点：局限于样品中总蛋白的检测，破坏蛋白质结构，
易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰
比色法-茚三酮法
✓ 茚三酮，又名苯并戊三酮，溶于水后与水分子结合形 成水合茚三酮，进而可与氨、一级胺、二级胺发生化学 反应生成紫蓝色或黄色缩合物。茚三酮法可用于水解蛋 白质的检测。
比色法-茚三酮法
以氨基酸为例，首先在弱酸性加热条件下氨基酸与水合茚酸酮发生氧 化反应，氨基酸脱去氨基和羟基变成醛类化合物，水合茚三酮吸收氨基并 脱去分水子变成胺合茚三酮。随后胺合茚三酮与茚三酮反应生成席夫碱， 并最终形成紫蓝色或黄、棕色化合物，产物颜色的深浅与蛋白质的浓度相 关，最大吸收波长为 570 nm 左右。
比色法-双缩脲法
✓ 原理：蛋白质含有两个以上的肽键，故有双缩脲（NH2CO-NH-CO-NH2）反应。在碱性条件下，肽键的质子被解离， Cu2+和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的紫色络合物， 在540～560 nm的光吸收值与蛋白质的含量在一定范围内呈 线性关系。由于与双缩脲试剂与不同种类的蛋白质反应产物 的颜色差别极小，使得该方法比较适合总蛋白质的检测。

试剂名称 氟化钠 正钒酸钠 焦磷酸钠 抑制作用 酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶 丝氨酸-苏氨酸磷酸
ppt课件
13
2.5 还原剂
. 防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。 DTT、β－巯基
乙醇等。
2.6 其它
水；溶剂; NaCl。
超纯水的电阻率就是单位厘米内的水 的电阻值。 即18.25MΩ*CM.
ppt课件 14
2.7 全蛋白抽提时注意事项
抑制蛋白酶及磷 酸酶
裂解液的用量
可以适量加入甘 油,稳定蛋白
注意事项
细胞或组织的样 本量
使 用 的 Detergent 的 种 类 纯度 浓度 干 扰 去除等因素
可以适量加入 Benzonase /DNase I等核酸 酶 , 去 除 DNA, 充 分提取蛋白,降 低提取的粘度.
一个稳定而不断向阳极移动的界面。
由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集 聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数
2、细胞裂解液
缓冲液 表面活性剂
其它：H2O、NaCl、等
RIPA Buffer
蛋白酶抑制剂
还原剂
磷酸酶抑制剂
ppt课件
10
2.2 表面活性剂
溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为
1 阴离子型: SDS，脱氧胆酸盐 2 阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型: CHAPS和Zwittergent系列 4 非离子型: Brij系列、Triton-100 、Nonidet P40、Tween 系列等
即可计算待测蛋白的浓度。
BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织 细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影

注意事项：全部操作需在冰上进行；需要加蛋白酶抑制剂；
蛋白定量标准曲线
原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质分子结合形成复合物，在
595nm处有最大光吸收，其值在一定范围内（0-50μg）与
蛋白浓度成正比。优点：简单易行；缺点：各种干扰因素较
大
考马斯亮蓝溶液 0.5mg/mL BSA ddH2O
1 3mL 0μL 100μL
封闭
封闭液：5%脱脂奶粉 封闭时间：室温1小时
Harry Towbin在1979年提出对单向电泳后的蛋白质分子的印 迹分析称为Western blot ，对双向电泳后蛋白质分子的印迹 分析称为Eastern blot 。
Western Blot的基本原理
在电场的作用下，将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白 质混合物从凝胶转移至固相支持膜上，再利用某种蛋白（目 的蛋白，如GAPDH）的特异性抗体来对其进行鉴定，可进 行定量分析。
PH 8.3
浓缩胶（4%） PH 6.8
分离胶（5-15%） PH 8.8
分离胶浓度（％） 15 10 7.5 5.0
线性分离范围（kD) 12-43 16-68 36-94 57-212
胶浓度
4%(浓缩胶)
dd H2O
凝胶储备 液
（mL）
Gel buffer (mL)
6.1

1.3
2.5
10% V/V SDS (mL)
SDS-PAGE （SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳）
蛋白质电泳的行为：带电性和分子量
原理：SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子 也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋 白质之疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水 分子作用，由于 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道, 所 以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。

移 (photo-induced electron transfer PET）, 分子内电荷转移
( Intramolecular charge transfer , ICT)等效应对蛋白质进行选
择性识别
26
精品课件
✓ 基于自组装机理检测蛋白质
超分子化学：分子聚集体结构和功能为研究对象, 旨在 研究分子基于弱相互作用的组装、自组装和自组织行为,并 研究这些行为可能带来的结构和功能的改变,以期建立结构 和功能之间的关系。超分子的组装的实现依赖于分子间键. 它包括氢键、范德华力、亲脂-疏水作用、金属离子的配位 键、π-π堆积作用等
曙红Y
23
铬天青S
精品课件
溴酚蓝
Evans blue
24
四羧基苯基卟啉
精品课件
偶氮染料
方酸菁染料
酞菁染料
25
精品课件
✓ 基于AIE机理检测蛋白质
✓ 此外，小分子荧光探针还可基于荧光能量共振转移
(fluorescence resonance energy transfer, FRET),光诱导电子转
17
精品课件
近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。
12
精品课件
比色法-BCA法

✓优点：极高的显色灵敏度 和良好的检出限
✓缺点：水合茚三酮和不同 的氨基酸显色程度有所差 异，蛋白质水解程度的不 同容易对测量结果造成较 大误差。此外，茚三酮显 色剂的稳定性较差，不利 于长期存储
15
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
18
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
4
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
免疫印迹法检 测样品中特异 蛋白质的基本 流程
5
样品的凝胶电泳 蛋白印迹 封闭反应
与特异性抗体（一抗）孵育 与酶耦联的二抗孵育 显色或化学发光显影 观察和记录结果
✓ 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回 收
✓ 缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中 含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出 现较大的干扰
7
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
16
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。 ✓ 优点：绝大多数的有机物都有吸收响应，所以测量时几乎 无需进行样品前处理 ✓ 缺点：吸收系数小，其检测限通常不到 0.1%，不利于对蛋 白质的衡量分析

WB：WesternBlot-蛋⽩质印迹法「源」是格源致善对在个性化肿瘤疫苗研究领域内有重⼤突出贡献的⼈物或创新性的事件进⾏报道的专题。

⼀、蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，简称WB。

它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。

Western blot的发明者⼀般认为是美国斯坦福⼤学的乔治·斯塔克（GeorgeStark）。

在尼尔·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析⽣物化学》（AnalyticalBiochemistry）中⾸次被称为WesternBlot。

WB的基本原理：在电场的作⽤下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移⾄⼀种固相⽀持体，然后⽤这种多肽的特异抗体来检测，经常⽤于⽬的蛋⽩的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋⽩的互作。

依其原理，可分为直接法和间接法两种⽅法，两种⽅法的⽐较如表1表1 WB直接法和间接法的⽐较⼆、WB实验步骤Western Blot的内容主要包括以下⼏个步骤：1）制样：裂解缓冲液或者超声处理。

（使⽤RIPA裂解液是需按照100:1加⼊蛋⽩酶抑制剂）2）电泳：根据蛋⽩⼤⼩确定合适的PAGE胶浓度，推荐上样量为20-30ug总蛋⽩。

3）转膜：湿转和半⼲转都可。

但在待检测蛋⽩分⼦量较⼤或低内源⽔平湿转移⽅法更佳。

4）洗膜：10min/次*3次。

5）封闭：含5%脱脂奶粉的TBST中封闭1h。

6）洗膜：TBST中洗涤10min。

7）孵育⼀抗：⼀抗应在含5% BSA 或5% 脱脂⽜奶的 TBST 缓冲液中稀释，参考产品说明书选择合适的⼀抗稀释⽐例。

5%推荐使⽤脱脂奶粉的TBST缓冲液，背景相对较低。

⼀抗4℃孵育过夜更好。

8）洗膜：10min/次*3次。

9）孵育⼆抗：建议在含5%脱脂⽜奶TBST中稀释⼆抗.参考⽣产商建议选择合适的⼆抗稀释⽐例。

10）洗膜：10min/次*3次。