第六章I_目的基因与载体的连接

性的确定；（2） cDNA 的合成和克 隆；（3）目的cDNA的鉴定等步骤。 (1) 总RNA的提取 (2) mRNA的分离 (3) mRNA的纯化 (4) cDNA第一条链的合成:①随机引物法； ②oligo-dT(12-18)引物法 (5) cDNA第二条链的合成 (6) cDNA的甲基化和接头的加入 (7) cDNA同载体的连接 (8) 噬菌体蛋白的体外包装 （9）噬菌斑原位杂交分离基因



2 用TRIZOL试剂盒提取总RNA 1) 匀浆 在 1ml 的 TRIZOL 试剂中加 50-100mg 组织，样 本体积不应超过 TRIZOL 的 10% 。用匀浆机高 速匀浆2分钟。 2)（可选） 要分离蛋白、脂肪、多糖或细胞外物质如肌肉、 脂肪组织，在匀浆后2-8℃ 12000g离心10分钟。 将上清匀转移至一新的Eppendof管。 3) 分相 15-30℃温育5分钟，完全解离核蛋白复合体。 加0.2ml氯仿，用力摇动15秒，15-30℃放置23分钟。小于12000g 2-8℃离心15分钟。


6.2 c 基因的分离 cDNA的克隆对于特定基因的分离类型中已经被转 录成m同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特 定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各 自的 mRNA次后，上清加 1/10体积3M 乙酸钠和3倍体积无水乙醇，在－ 20℃沉淀过夜。 6）12000rpm离心15min，沉淀溶于0.5ml STE中，加蛋白酶K至200μg/ml，56℃消化1h。 等体积热苯酚：氯仿抽提，冷却离心，重复一 次。 7）上清加2.5倍体积无水乙醇沉淀过液。离心， 70%乙醇洗沉淀，干燥后，溶于
基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、 扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展 核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。 通常将那些已被或者准备要被分离、改造、 扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目 的基因。 要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小 的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第 一个难题。欲想获得某个目的基因，必须对 其有所了解，然后根据目的基因的性质制定 分离的方案。

4、实施基因工程的第一步的一种方法是把所需的基 因从供体细胞内分离出来，这要利用限制性内切酶。 一种限制性内切酶能识别ＤＮＡ分子的ＧＡＡＴＴ Ｃ顺序，切点在Ｇ和Ａ之间，这是利用了酶的 Ａ、高效性 Ｃ、多样性 Ｂ、专一性 Ｄ、催化活性易受外界影响
B
5、基因工程的正确操作步骤是 C ①使目的基因与运载体结合 ②将目的基因导入受体细胞 ③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求 ④提取目的基因 Ａ、③②④①
转基因龙胆花色奇异
转基因蓝猪耳改变花色
转基因牵牛花改变了花色
A：紫外光照射下的转 绿色荧光蛋白的 Eustoma (Lisianthus) 花。
B：转没有绿色荧光 蛋白的空质粒的花，
2、基因工程与药物研制
用基因工程的方法 生产胰岛素、干扰素、 白细胞介素、凝血因子、 以及预防乙肝、霍乱、 伤寒、疟疾等的疫苗。 提高生产产量、降 低生产成本。 我国生产的部分基因 工程疫苗和药物
限制酶
被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有 相同的黏性末端？ 是的。因为酶具有专一性。
基因的针线——DNA连接酶
作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使 之成为一个完整的DNA分子。
磷酸二酯键
使用DNA连接酶制作重组DNA分子
AATTCCGTAG GGCATCTTAA
甲片段
CTTCATG AATTCCGTAG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGCATCTTAAGGGATT
3、基因工程与环境保护
基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检 测环境中的病毒、细菌等污染。
1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来
利用基因工程培育的“指示生物”能十分 灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污 染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。

dna重组技术实验报告一、实验目的DNA 重组技术是现代生物技术的核心之一，通过本次实验，旨在掌握 DNA 重组的基本原理和操作方法，包括限制性内切酶切割、DNA 片段连接、转化和筛选等步骤，从而实现将外源 DNA 片段插入到载体中，构建重组 DNA 分子。

二、实验原理1、限制性内切酶切割限制性内切酶能够识别特定的 DNA 序列，并在该序列内或附近切割 DNA 分子，产生具有粘性末端或平末端的 DNA 片段。

2、 DNA 连接酶连接DNA 连接酶能够将具有互补粘性末端或平末端的 DNA 片段连接起来，形成完整的 DNA 分子。

3、转化将重组 DNA 分子导入受体细胞（如细菌），使其获得新的遗传特性。

4、筛选通过特定的筛选标记（如抗生素抗性基因），筛选出含有重组DNA 分子的受体细胞。

三、实验材料与设备1、材料（1）载体 pUC19 质粒（2）目的基因片段（如绿色荧光蛋白基因）（3）限制性内切酶 EcoRI 和 HindIII（4）DNA 连接酶（5）感受态细胞（大肠杆菌）（6）LB 培养基（7）氨苄青霉素（8）琼脂糖（9）DNA 分子量标准（10）PCR 引物2、设备（1）恒温培养箱（2）高速离心机（3）移液器（4）电泳仪（5）凝胶成像系统（6）PCR 仪四、实验步骤1、目的基因的获取通过 PCR 技术从含有目的基因的模板 DNA 中扩增出目的基因片段。

设计特异性的 PCR 引物，在引物的 5'端分别引入 EcoRI 和 HindIII的酶切位点。

进行 PCR 反应，反应体系包括模板 DNA、引物、dNTPs、Taq DNA 聚合酶和反应缓冲液。

设置合适的 PCR 反应条件，如变性温度、退火温度和延伸温度，经过一定的循环次数后，获得目的基因的PCR 产物。

2、载体的酶切使用限制性内切酶 EcoRI 和 HindIII 对载体 pUC19 质粒进行双酶切。

在无菌的离心管中，依次加入适量的 pUC19 质粒、EcoRI 内切酶、HindIII 内切酶、反应缓冲液，然后用无菌水将反应体系补足至一定体积。

遗传与进化第六章从杂交育种到基因工程第一节杂交育种与诱变育种杂交育种【概念】杂交育种是将两个或多个品种的优良性状通过交配集中在一起，再经过选择和培育，获得新品种的方法。

【原理】基因重组（自由组合或交叉互换），即控制不同优良性状的基因通过减数分裂和受精作用重新组合在一起，产生新的基因型，从而使人们所需要的位于不同个体上的优良性状集中到一个个体上。

【过程】（1）具有优良性状的两个亲本杂交。

（2）F1表现出显性性状，让F1自交，获得F2。

（3）从F2中选出符合要求的性状进行多次自交纯化获得新品种。

【优缺点】（1）优点：可以将两个或多个品种的优良性状集中在一起。

（2）缺点：不会创造新物种，且杂交后代会出现性状分离，育种过程漫长，操作复杂。

杂交育种的适用范围和技术要求（1）适用范围：同一物种不同品种的个体间。

亲缘关系较近的不同物种个体间（为了使后代可育，应做染色体加倍处理，得到的个体即是异源多倍体），如八倍体小黑麦的培育、萝卜和甘蓝杂交。

（2）技术要求：①材料的选择，要求所选育的材料分别具有我们所期望的个别性状；所选的原始材料，是能稳定遗传的品种，一般是纯合子。

②杂交一次，获得的F1是杂合子，不管在性状上是否完全符合要求，一般情况下，都不能直接用于扩大栽培。

③让F1自交得到F2。

性状的重新组合一般是在F2中出现，选出性状上符合要求的品种，这些品种有纯合子也有杂合子。

④把初步选出的品种进行隔离自交，根据F3是否出现性状分离，确定被隔离的亲本是否是纯合子。

如果是纯合子，F3不会出现性状分离，且基因型与亲本相同。

诱变育种【概念】利用物理因素（如X射线、Y射线、紫外线、激光等）或化学因素（如亚硝酸、硫酸二乙酯）等处理生物，使生物发生基因突变。

【原理】基因突变。

基因在自然条件下的突变率很低，人们利用物理或化学的方法处理生物，诱发基因突变，提高变异的频率，然后从获得的大量突变个体中选择出具有优良性状的个体。

【诱变因素】（1）物理因素：X射线、Y射线、紫外线以及激光等的照射都可以使生物在DNA复制过程中发生基因突变。