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质粒DNA的小量提取与DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告

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.. .. .. .专业资料. 质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳

一、前言 质粒 质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。 天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。 质粒在细胞的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞只含有一个或几个质粒分子，如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，.. .. .. .专业资料. 一般在20个以上，如 Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。其自我复制能力及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性:⑴分子量小、多拷贝、松弛控制型;⑵具有多种常用的限制性切酶的单切点;⑶能插入较大的外源DNA片段;⑷具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和筛选。⑸对宿主细胞无害。常用的质粒载.. .. .. .专业资料. 体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。 质粒的不兼容性 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性。 琼脂糖凝胶 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是:它兼有"分子筛"和"电泳"的双重作用。 .. .. .. .专业资料. 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太小，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。 蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

二、实验目的 1.学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA 2.学习和掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作。

三、实验原理 .. .. .. .专业资料. 1.质粒DNA的小量提取 碱裂解法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的变性与复性的差异达到分离的目的。 在强碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，彼此互相盘绕，仍会紧密地结合在一起。当将pH调到中性并有高浓度盐存在时，变性质粒DNA又回复到原来的结构保存在溶液中，而染色体DNA不能复性，相互缠绕形成不溶性网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子DNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。提取的质粒DNA再用酚、氯仿抽提进一步纯化。 2.DNA琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是最常用的鉴定DNA的方法，它简便易行，只需少量DNA。 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。DNA分 观察琼脂糖凝胶中DNA的最简便方法是利用荧光染料溴乙锭（EB）染色，EB在紫外灯照射下，发红色荧光，本实验使用Goldview。

四、实验器材和材料试剂 .. .. .. .专业资料. 1.实验材料 菌种：含质粒PET28a的大肠杆菌 2.实验试剂： （1）溶液I： 50mmol/L 葡萄糖溶液 25mmol/L Tris-Cl (pH8.0) 10mmol/L EDTA (pH8.0) （2）溶液II：0.4mol/L NaOH, 2%SDS 用前两者等体积混合，需新鲜配制 （3）溶液III:3mol/L的乙酸钾 （ pH4.8） 3mol/L乙酸钾60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml （4）酚/氯仿试剂： V（酚）：V（氯仿，含1/24异戊醇）=1:1 （5）TE缓冲液 10mmol/L Tris-Cl (pH7.4-8.0) 1mmol/L EDTA (pH8.0) （6）LB培养基 蛋白胨 10g 酵母浸出粉 5g NaCl 10g .. .. .. .专业资料. 溶解在1L水中，调pH至7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。 （7）氨苄青霉素（Amp）：使用浓度为50-100ug/ml （8）pH8.0 TAE缓冲液 （9）凝胶上样缓冲液：0.2%溴酚蓝，50%蔗糖 （10）琼脂糖 （11）1mg/ml EB溶液 （12）Marker （13）PCR扩增特异DNA片段 3.实验器材： （1）Eppendorf管 （2）移液器 （3）恒温培养箱 （4）低温高速离心机 （5）涡旋混合器 （6）水平电泳槽 （7）紫外检测仪 （8）微波炉 （9）水平仪 （10）一次性手套 （11）锥形瓶 （12）量筒 （13）tip

五、实验操作 质粒DNA的小量提取 １.菌种培养 将含PET28a的大肠杆菌接种于LB（含Amp）中，37℃振荡培养过夜。 .. .. .. .专业资料. ２.质粒提取 （1）取1.5ml培养液倒入Eppendorf管中，4℃,8000rpm，离心5min。 （2）弃上清，使细胞沉淀尽可能干燥。 （3）将菌体沉淀悬浮于100ul溶液I中，用涡旋振荡器振荡1min，置冰浴10min。 （4）加200ul溶液II，盖紧管口，快速来回颠倒3次，使容物充分混合，不要振荡，至冰浴中3min。 （5）加150ul溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次并轻轻振荡混匀，冰浴5min。 （6）4℃，12000rpm，离心5min，将上清液移入另一Eppendorf管中。 （7）向上清液中加入等体积酚/氯仿（1:1），用涡旋振荡器振荡1-2min，4℃，10000rpm，离心2min，将上清液移入另一Eppendorf管中。 （8）加入等体积氯仿，重复上面的操作。 （9）加入1/10体积的2.5mol/L乙酸钠，再加2倍体积的无水乙醇，混匀后室温放置5min， 4℃，12000rpm，离心15min，弃上清，将Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 （10）加1ml70%乙醇振荡漂洗沉淀， 4℃，12000rpm，离心2min，弃上清。 （11）将Eppendorf管倒扣在吸水纸上，使乙醇流尽，空气中干

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质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物

质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物

质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。

9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。

10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。

大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

(完整版)质粒DNA的提取、纯化与鉴定

(完整版)质粒DNA的提取、纯化与鉴定

分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。

2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。

3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。

4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。

5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。

其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。

该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。

提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。

少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。

细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。

在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。

当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。

B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。

(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。

DNA琼脂糖凝胶电泳分析

DNA琼脂糖凝胶电泳分析

DNA琼脂糖凝胶电泳分析
3. 加样
• 将DNA样品（5ul）与6 × 上样缓冲液（1ul） 混匀后， 用微量加样枪小心加入样 品孔内。
– 注意加样枪的枪头不可插入 过深，以免刺穿凝胶，导致 样品外溢。
• 每加完一个样品要更换枪 头，以防止EB污染。电泳
• 接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切 记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的 一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极 之间的距离计算）
• 此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA条带,用于以后的克隆操作。
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
电泳指示剂：
• 核酸电泳常用的指示剂有两种 – 溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）； – 二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ）， 它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝 胶中的迁移率比溴酚蓝慢
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
• 银染色
– 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形 成稳定的复合物，然后用还原剂如甲 醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳 带染成黑褐色。
– 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色， 也用于琼脂糖凝胶染色。
– 灵敏度比EB高200倍，但银染色后， DNA不宜回收
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
• 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，
停止电泳
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
5. 结果观察
• 电泳结束后，将凝胶板取出。 在紫外仪上观察电泳带及其位 置，记录实验结果。
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
注意事项
1、 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否 则温度太高会使制板变形；
• 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下， 使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而 达到分离核酸片段检测其大小的目的。