干细胞定向分化
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组织干细胞的培养及定向分化实验邵志华;许洁;沙继宏;吕立夏;徐磊;李姣;贾松;李思光【期刊名称】《实验室研究与探索》【年(卷),期】2015(034)001【摘要】如何将医学教育与前沿科学知识和实验技能结合,使学生及时了解科学发展的动态,在传承经典的同时掌握前沿科学知识和实验技能成为当今医学教育的新课题.实验以经典的细胞培养为主线,结合科学发展前沿的干细胞生物学,采用原代培养—传代培养—定向分化—染色鉴定4个连续的实验,建立了一个具有系统性、连续性和完整性的综合实验.实验项目融入了科技创新的成果,注重科研成果转化教学的应用,体现了基础与前沿的结合、经典与现代的结合,对培养学生的科学思维能力和解决问题的能力,掌握前沿科学知识和实验技能具有重要意义.【总页数】4页(P165-167,233)【作者】邵志华;许洁;沙继宏;吕立夏;徐磊;李姣;贾松;李思光【作者单位】同济大学医学院干细胞研究中心,上海200092;同济大学医学与生命科学实验教学中心,上海200092;同济大学医学院干细胞研究中心,上海200092;同济大学医学院干细胞研究中心,上海200092;同济大学医学与生命科学实验教学中心,上海200092;同济大学医学院干细胞研究中心,上海200092;同济大学医学与生命科学实验教学中心,上海200092;同济大学医学院干细胞研究中心,上海200092【正文语种】中文【中图分类】Q2-33;G642.0【相关文献】1.人骨髓间充质干细胞的分离培养及向成骨细胞定向分化的实验研究 [J], 康非吾;吴正华;黄欣;唐休发;温玉明2.体外培养和诱导人脐带源间充质干细胞定向分化为心肌细胞的实验研究 [J], 阮中宝;杨向军;陈各才;朱莉;李伟;杨兵;欧阳溪;潘少辉3.大鼠骨髓间充质干细胞在特定培养液条件下向软骨细胞表型定向分化的实验 [J], 丁晓飞;赵劲民;陈维平;杨志;苏伟4.体外培养乳牙牙髓干细胞向血管内皮细胞定向分化的实验研究 [J], 刘琼;文军;吴小明;钱虹5.纹状体组织块诱导胚胎干细胞定向分化的实验研究 [J], 郭雨霁;高英茂;邴鲁军因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
生物学中的细胞分化细胞分化是生物学中重要的概念,它指的是一个原始细胞逐渐发展为具有特定功能和结构的细胞类型的过程。
这一过程在生物体发育和维持组织结构中起着至关重要的作用。
细胞分化研究的深入不仅拓宽了我们对生物体的认识,还为医学和生物技术领域的进展提供了基础。
一、细胞分化的基本原理细胞分化是通过基因表达调控实现的。
在一个多细胞生物体中,每个细胞都携带有相同的基因组,但特定基因的表达模式决定了细胞类型的形成。
细胞分化的过程中,特定的基因被激活或失活,使细胞逐渐发展为特定功能细胞。
细胞分化通常发生在多细胞生物体的早期发育阶段。
最初,原始细胞是无差异的,称为干细胞。
随着发育的进行,细胞将根据其所处的环境和位置接受特定的信号和激素,导致基因表达的改变。
这些信号和激素的作用引发了一系列的分化事件,以及特定功能和结构的形成。
二、细胞分化的类型细胞分化可以分为两种基本类型:定向分化和自由分化。
1. 定向分化:定向分化是指细胞在特定位置接受特定信号和激素导致分化的过程。
这种类型的分化通常在早期胚胎发育阶段发生。
通过不同的形态学和生理学特征,细胞将发展成组织和器官。
2. 自由分化:自由分化是指干细胞在体内受到损伤或刺激时能够主动分化为其他细胞类型的能力。
这种类型的分化通常在成体的组织修复和再生过程中发生。
三、细胞分化的重要意义细胞分化的研究对我们理解生物体的发育过程和维持组织结构具有重要意义。
以下是一些细胞分化的重要意义:1. 生物发育:细胞分化是使干细胞逐渐发展为形态和功能不同的细胞类型的过程。
在胚胎发育过程中,细胞分化为不同的胚层和组织,从而构建出成体。
2. 组织修复和再生:细胞分化过程中的干细胞可以通过自由分化的方式参与组织修复和再生。
这对创伤修复、器官移植和疾病治疗等领域具有潜在的应用前景。
3. 癌症研究:细胞分化的失调与癌症的发生和发展密切相关。
癌细胞常常失去分化能力,从而形成恶性肿瘤。
深入研究细胞分化机制对于癌症的治疗和预防具有重要意义。
干细胞分化的心肌细胞会跳动的原因
干细胞分化的心肌细胞会跳动的原因可以从以下几个方面来解释:1. 电生理功能:诱导多能干细胞分化的心肌细胞具有窦房结样、心房样和心室样的动作电位,这意味着它们拥有自发的电生理活动,也就是跳动的基础。
2. 信号传导:通过研究发现,肾上腺素可以提高诱导多能干细胞分化的心肌细胞自发搏动频率,这就说明了信号的传导对心肌细胞的跳动起着重要的作用。
3. 心肌收缩:心肌细胞中的肌钙蛋白T呈阳性表达,这说明在心肌细胞收缩时,肌钙蛋白T会发生变化,从而导致心肌细胞的收缩。
而诱导多能干细胞分化的心肌细胞可以模拟心脏跳动时肌肉收缩的方式游动,也就证明了心肌收缩的功能存在于诱导多能干细胞分化的心肌细胞中。
4. 自发活动:诱导多能干细胞分化的心肌细胞具有自发的搏动,这是跳动的基本条件,这也证明了诱导多能干细胞分化的心肌细胞具有自发的跳动能力。
5. 构建特定的微环境:研究发现,全心组织裂解液可诱导骨髓间充质干细胞形成心肌组织样结构,心房肌组织裂解液可诱导骨髓间充质干细胞向心房肌样细胞分化,心室肌组织裂解液可诱导骨髓间充质干
细胞向心室肌样细胞分化。
通过构建特定的微环境,骨髓间充质干细胞可以定向分化形成不同部位的心肌样细胞。
这也证明了心肌细胞的跳动需要特殊的微环境来调节和控制。
因此,干细胞分化的心肌细胞跳动的原因是多方面的,包括其具有的电生理功能、信号传导、心肌收缩、自发活动以及特定的微环境等因素。
人源多能干细胞体外定向诱导分化为肝细胞杜盼;余江南;徐希明【摘要】目的:探索人源诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在体外二维条件下诱导分化生成肝细胞的条件,并初步探讨三维条件下hiPSCs的肝细胞诱导分化.方法:通过测定4种诱导培养基中白蛋白和甲胎蛋白含量,筛选诱导分化的最佳方案.用筛选出的最优培养基对hiPSCs进行二维培养,采用免疫荧光法、蛋白质印迹法检测诱导后的细胞中肝脏标志蛋白的表达,采用酶联免疫吸附法检测肝细胞功能相关蛋白的含量;对hiPSCs进行三维培养,用酶联免疫吸附法对比二维与三维条件下肝细胞功能,并用HE染色法观察三维条件下形成细胞的形态.结果:二维条件下诱导分化23 d,倒置显微镜下细胞呈典型的肝细胞形态;免疫荧光法、蛋白质印迹法检测到诱导分化后的细胞阳性表达肝脏特征蛋白(甲胎蛋白、白蛋白、角蛋白CK8、角蛋白CK18、SOX17),且与胚胎干细胞来源肝细胞(hESCs-HEPs)内含量相近;酶联免疫吸附法测定结果显示,诱导形成的肝细胞具有正常肝细胞功能,表明hiPSCs已分化为肝细胞;HE染色结果显示三维条件下诱导形成的细胞具有明显双核,呈现典型肝细胞形态;酶联免疫法测定结果显示,三维条件下,诱导形成的肝细胞功能没有受到损伤,仍具有正常肝细胞功能.结论:在二维与三维培养体系下,采用最佳诱导分化方案,hiPSCs能够被诱导分化为肝细胞,且表达肝脏相关蛋白,并具有正常肝细胞功能.%Objective:Exploring the optimal conditions of human induced pluripotent stem cells ( hiP-SCs) committed differentiation into hepatocytes under two-dimensional condition in vitro, and differentia-tion under three-dimensional condition .Methods: The hepatocyte-induced differentiation medium was screened and optimized , and the optimal scheme was obtained by measuring the expression of albumin and AFPunder four different differentiation medium .The hiPSCs were cultured under two-dimensional condition .The expressions of liver marker protein were detected by immunofluorescence and Western -blot-ting.ELISA was used to investigate the function of hepatocytes .The hiPSCs were cultured under three-di-mensional condition .Cell morphological changes were observed by HE staining , and compared the func-tion of hepatocytes by ELISA under two and three-dimensional condition .Results:After 23 days of dif-ferentiation under two dimensional condition , the cells observed in inverted microscope showed typical hepatocyte-like morphology, and positive expression of AFP, albumin, CK8, CK18 and SOX17 by im-munofluorescence and Western-blotting , which was similar to that of embryonic stem-derived hepatocytes ( hESCs-HEPs) .The result of ELISA showed that cells differentiated from hiPSCs had normalfunction ,indicating that hiPSCs had differentiated into hepatocytes .The results of HE staining showed that cells differentiated from hiPSCs had obvious dual nuclei under three-dimensional condition , and it was the morphology of typical hepatocyte .The results of ELISA showed that the function of cells were not abnor-mal .Conclusion:In the two and three-dimensional conditions ,hiPSCs can be induced to differentiate in-to hepatocytes, expressing liver-related proteins, and had normal function .【期刊名称】《江苏大学学报(医学版)》【年(卷),期】2018(028)001【总页数】8页(P39-46)【关键词】人源诱导多能干细胞;肝细胞诱导;体外分化;三维支架【作者】杜盼;余江南;徐希明【作者单位】江苏大学药学院,江苏镇江 212013;江苏大学药学院,江苏镇江212013;江苏大学药学院,江苏镇江 212013【正文语种】中文【中图分类】R329.2原位肝移植是目前唯一能有效治疗肝脏严重疾病的方法[1-2]。
影响胚胎干细胞定向分化的因子包括转录因子、细 胞因子以及化学诱导剂的体外诱导,同时也包括通过共 培养和表观遗传修饰进行的诱导[27]。这其中对于细胞因 子领域研究较多。最新研究表明,Jumonji能够通过调节 Polycomb抑制复合物2(PRC2)的功能,从而维持胚胎干细 胞自我更新和分化间的平衡,一旦Jumonji缺失,便会抑 制胚胎干细胞的分化[28,29]。而对于PRC对胚胎干细胞分化 的调节机制,研究人员发现PRC复合体的重要成分Ezh2是 通过抑制Ink4A-Ink4B位点,从而调节细胞的分化率[30]。 此外,还有研究发现,Chd1基因能够通过控制核染色质 的开放从而调节胚胎干细胞的分化[31]。美国、加拿大和英国的科研 人员在2008年发现了一种“干细胞自我维持稳态”,这 种理论与现行的主流观点相反,认为胚胎干细胞的增殖 和多能性并不依赖于外界刺激,而是自身固有一套自我 更新和分化的程序[32] 目前,大部分关于胚胎干细胞的研究均以小鼠作为 研究对象,因此,对于胚胎干细胞定向分化的研究所得 到的有效诱导因子大部分是针对小鼠的。然而,研究发 现,用于诱导小鼠胚胎干细胞定向分化的因子对于诱导 人类胚胎干细胞向特定细胞的分化并不是都有效,比如 在人类胚胎干细胞中,苯丙酸诺龙(activin-A)和转化生长 因子(transforming growth factor,TGF)只能诱导中胚层的 形成,视黄酸(retinoic acid,RA)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein,BMP-4)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)促使细胞向外胚层和中胚 层分化,然而神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)促使人类 ESC向三个胚层的细胞分化,BMP-4还能诱导人类ESC发 育为滋养层的细胞[33] 间充质干细胞最初是从骨髓中分离获得,随着研究 的不断深入,目前从脂肪组织、骨外膜、滑膜、骨骼 肌、表皮、血液、骨小梁、人脐带、肺、牙髓、牙周膜 等组织中均能够分离获得间充质干细胞。骨髓间充质干 细胞具备易于分离、培养、扩增和纯化,多次传代扩增 后仍具有干细胞特性,不存在免疫排斥,体外基因转染 率高并能稳定高效表达外源基因等优点,因此骨髓间充 质干细胞成为近年干细胞研究的热点。 自从2001年首次成功分离脂肪来源间充质干细胞以 来,由于其不仅与骨髓间充质干细胞的生物学特性相 似,具有很强的体外扩增能力和多向分化潜能,经过多 次传代后细胞增殖能力没有明显的降低,最重要的是其 来源充足、易于分离培养,使其成为继骨髓间充质干细 胞之后的研究新热点,并呈现出良好的发展前景[34]。此外,近年来,脐带组织在间充质干细胞领域的潜 力得到许多科研人员的重视。脐带血中的间充质干细胞 与骨髓间充质干细胞一样,也能够在体外分离、培养、 扩增,而且同样具有多项分化潜能,可诱导为脂肪细胞 和成骨细胞[35];还有科研人员比较了骨髓来源和脐带组 织来源的间充质干细胞在体外造血能力的差异,发现脐 带间充质干细胞也能够在体外支持长期的造血,但是其 造血能力要弱于骨髓间充质干细胞[36]。脐带组织来源的 间充质干细胞还具有细胞较原始、污染较少、免疫原性 低、外源基因易表达等优点,在间充质干细胞的临床应 用中具有广阔的发展前景。 [ 2 7 ] 梁贺, 等. 胚胎干细胞及诱导多能干细胞向心肌 细胞分化和调控的研究进展. 生命科学, 2 0 0 9 , 2 1 ( 5 ) : 663-668. [28]Peng JC, et al. Jarid2/Jumonji Coordinates Controlof PRC2 Enzymatic Activity and Target Gene Occupancy in Pluripotent Cells. Cell, 2009. 139:1290-1302. [29]Shen XH, e t a l . Jumonj i Modul a t e s Polycomb Activity and Self-Renewal versus Differentiation of Stem Cells. Cell, 2009, 139:1303-1314. [ 3 0 ] E z h k o v a E , e t a l . E z h 2 Or c h e s t r a t e s Ge n e Expression for the Stepwise Differentiation of Tissue- Specific Stem Cells. Cell, 2009, 136: 1122-1135. [ 3 1 ]Ga s p a r -Ma i a A, e t a l . Ch d 1 r e g u l a t e s o p e n chromatin and pluripotency of embryonic stem cells. Nature, 2009, 460(13):863~868. [32]Ying QL, et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature, 2008, 453(22):519-523. [33]葛秀国, 李吉霞, 窦忠英. 胚胎干细胞体外分化研究进展.天津农学院学报, 2009, 16(3): 47-51. [34]薛君, 边云飞, 郭泽君. 人脂肪来源的间充质干细胞 的生物学研究.中国药物与临床, 2009, 9(3): 185-186. [35]于海微, 等. 人脐带血和骨髓来源间充质干细胞的体 外分离、培养、分化及生物学特性比较. 中国组织工程 研究与临床康复, 2009, 13(6): 1021-1024. [36]刘蒙, 等. 人骨髓和脐带来源间充质干细胞体外支 持造血能力的比较研究. 中国实验血液学杂志, 2009, 17(5): 1294-1300. DAC处于一个更为“年轻”的微环境中,这种微环境包括细胞、细胞外基质、微血管系统、细胞因子、信号分子、细胞表面分子以及细胞间相互作用等因素,类似于干细胞“龛”的结构[30]。如DAC呈现出的细胞浓聚现象有利于广泛的细胞-细胞、细胞-基质间的相互作用,从而在这个微环境中产生更多的信号分子及成分促进细胞间的交通。而由信号分子及细胞外基质介导的细胞间的交通被认为在牙齿形态发生的时间、空间调节上起关键作用[31-33]。此外,Tsukada等[34]发现在牙根延伸过程中,根端组织中持续存在大量血管网,丰富的血液供应可能提供更多的原始细胞和营养物质。DAC不仅是牙根和牙周组织发育的生长控制中心,也是牙根和牙周组织发育的干细胞龛,为牙根和牙周组织的发育持续不断地提供相应的干细胞以及必备的微环境。
牙齿发育是一个连续的过程,其发育过程中各个阶段都受到上皮-间充质相互作用的调控[35-38]。由于HERS在牙根发育中是暂时性的结构,仅由两层上皮细胞构成,细胞数量少,且被外胚间充质细胞包绕,故从牙根中单独分离HERS细胞相当困难。迄今为止,关于HERS细胞分离培养的报道还很少,因此,HERS在牙根和牙周组织发育中的具体作用还不太清楚。一些研究发现,在牙根发育过程中HERS在根尖末端始终未断裂[9,39]。另外的研究也证实,HERS甚至是Malassez上皮剩余(epithelial rests of Malassez,ERM)中均存在丰富的神经分布[40]。对于DAC的研究也表明,在牙根发育的整个过程中,HERS在牙本质根尖末端和上皮隔的部位始终保持完整性,并且存在增殖,提示HERS仍然作为一个有活性的组织存在于DAC中的可能性。因而推测DAC中可能存在上皮-间充质的相互作用,从而促进DAC中牙根和牙周组织前体细胞的分化。
先前的研究将原代DAC细胞进行差别消化培养,获得了纯化的上皮细胞(HERS细胞)和间充质细胞,包含HERS的DAC细胞形成了形态良好的牙根和牙周组织样结构,包括牙本质、牙骨质、牙周膜和骨样组织。而不包含HERS细胞的DAC仅形成了没有牙本质小管结构的骨样牙本质和无规则排列的纤维样组织。提示HERS在牙根和牙周组织发育中起重要作用,DAC作为一个功能性的整体在牙根和牙周组织共同发育中起作用,DAC中每种细胞成分对于牙根-牙周复合体的形成都是必需的。
将DAC细胞培养后收集培养液制备成DAC条件培养液,观察DAC条件培养液对牙囊细胞增殖分化的影响。结果显示,经DAC条件培养液诱导后,牙囊细胞增殖受到抑制,碱性磷酸酶(alkaline phos-phatase,ALP)活性增强,表达矿化组织形成细胞和牙周膜成纤维细胞的相关蛋白,在牙本质载体中生成大量的骨样组织和纤维组织,免疫组化确定矿化组织为骨组织[41]。结果揭示在DAC条件培养液中含有多种与牙根和牙周组织发育相关的生物活性因子,DAC细胞条件培养液可以诱导牙囊细胞向成骨细胞、成纤维细胞分化。将DAC条件培养液作用于牙周膜干细胞,同样可以诱导牙周膜干细胞向成牙骨质细胞谱系和成骨细胞谱系分化,并且可在体内异位形成牙周膜牙骨质复合体样结构以及骨样结构。