Illumina测序文件原始数据下载列表

2.简述illumina测序的主要流程

Illumina测序是一种高通量的基于 sequencing by synthesis (SBS) 技术的DNA测序技术，可以快速准确地测量细胞内的基因组。Illumina测序将 RNA 或 DNA 初始物质样品从 DNA 复制和延伸等步骤中获得特定长度的小片段，将每个片段连接到携带反信号的假测序引物上，并且将片段序列以多个反复循环的序列读取步骤完成最终测序结果。该SBS技术是一种利用一种好链式复制（clonal amplification）在全基因组测序中，利用荧光探测技术，来实现序列信息的高通量检测的算法。

Illumina测序的主要流程如下：

(1) DNA 上机分析。首先，使用特定的库存酶将母本（比如 DNA 样本）切分成短序列片段，然后将含反信号的假测序引物附着在每个序列片段的双端。这样的序列片段在碱基子酶中是未知的。

(2) 将 DNA 初步上机分析的结果以温度和酶存在梯度的方法聚类算法进行聚类，得出一个若干列特定双端序列片段的特征向量矩阵/矩阵，这里的温度和酶可根据设计的测序空间大小来调整。最终，得出若干个基于此矩阵的校正序列片段。

(3) 将聚类得到的特定序列片段与其他包含双端序列标记的片段混合，在启动耦合上机读取，这一步也叫芯片分析或链状化学地图（chain chemical map）。

(4) 将短序列片段在芯片上测定，从而进行链状化学地图，测定的结果再反馈到芯片上，以确定位置。

(5) 最后，利用短序列片段的位置信息，将其重新组装成完整的 DNA 序列，并进行信噪比（Signal- to-Noise Ratio，SNR）分析，从而获得高准确率的基因组序列信息。

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实用文档. 第一个要给大家讲的，是它这个flowcell。Flowcell翻成中文，就叫“流动池〞。

我们来看这个图片。图片当中，我们看到一个象载玻片大小的芯片。这个芯片里面，是做了8条通道。在这个通道的内外表，是做了专门的化学修饰。它的化学修饰，主要是用2种DNA 引物，把它〔2种DNA引物〕种在玻璃外表。

这两种〔DNA引物的〕序列是和接下来要测序的DNA文库的接头序列相互补的。而且这2种引物是通过共价键，连到Flowcell上去。之所以要用共价键连到Flowcell上去，是因为接下来有大量的液体要流过这个Flowcell，只有有共价键连接的这些DNA，才不会被冲掉。这就是Flowcell。

再接下来，讲一下文库、和文库的制作〔过程〕

所谓的DNA文库，实际上是许多个DNA片段，在两头接上了特定的DNA接头，型成的DNA混合物。

文库有2个特点，第1个特点，是当中这一段插入的DNA，它的序列是各种各样的。第2个特点，它的两头的接头序列，是的，而且是人工特地加上去的。

要做这个文库，首先是把基因组DNA，用超声波打断。然后打断之后，两头用酶把它补平，再用Klenow酶在3’端加上一个A碱基。然后，再用连接酶把这个接头给连上去。

连好了接头的DNA混合物，我们就称为一个“文库〞。英文也称作“library〞。

做好了Library之后，就要做桥式PCR了。桥式PCR，实际上是把文库种到芯片上去，然后进行扩增，这样的一个过程。

这个过程，首先是把文库参加到芯片上，因为文库两头的DNA序列，和芯片上引物是互补的，所以，就会产生互补杂交。 .

实用文档. 杂交完了之后，我们在这里面参加dNP和聚合酶。聚合酶会从引物开始，延着模板合成出一条全新的DNA链来。

新的这条链，和原来的序列是完全互补的。

接下来，我们再参加NaOH碱溶液。DNA双链在NaOH碱溶液存在下，就解链了。而且被液流一冲，原来的那个〔模板〕链，也就是没有和芯片共价连接的链，就被冲走了。而和芯片共价连接的链，就被保存下来。

1 / 17 RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理 在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤： 1. 建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。 2. 测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。深度为10-30 Million reads。） 3. 分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。 大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解 建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。 这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。 首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。 接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。 然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。 再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。 对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对） 2 / 17 在双链cDNA的两端加分别上Y型接头 再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。 这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。 因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。那么如果mRNA发生了降解，也就是mRNA断掉了，那么磁珠所吸附下来的片段，都是那些靠近3'端的那些断片，而那些5'端的断片，是吸附不下来的。会在富集过程中被洗脱掉。这样进行数据分析的时候，就会发生一定的数据偏差。 同时，为了保证能够测到尽可能完整的mRNA序列，Illumina公司建议：先对总RNA进行一次质量检测。 一般是用Agilent公司出品的Bioanalyzer 2100毛细管电泳仪，对总RNA样本进行一次电泳质检。根据18S和28S这两个核糖体RNA的电泳峰是否高、是否尖，来判断RNA的质量。这两个峰越高、越尖，也就说明RNA的降解就越少，完整度就越高。 同时系统会自动打分。这个分值，叫“RIN”值。也就是RNA的完整度评分值。是“RNA Integrity Number”的英文首字母缩写。这两个峰越高、越尖，那么打分，也会越高。（之前说过，越高越尖说明RNA完整度越好）RIN值最高是10分，最低是0分。 Illumina公司推荐用RIN值在8.0以上的RNA进行建库和测序。 Illumina测序即二代测序技术通常是RNA-seq测序中最常用的。接下来，我们简单了解一下它的原理。先说flow cell ，它是含有管道的一片玻璃，是测序反应发生的位置。 然后在接上接头之后，我们首先要进行桥式PCR。 3 / 17 首先是右图第一步接好接头，然后将DNA样品调整到合适的浓度加入到flowcell中，再加入特异的化学试剂。就可以使得序列的一端与flowcell上面已经存在的短序列通过化学键十分强健地相连。如左图。图中不同的颜色表示的是两种不同的接头，分别对应序列之前加入的两种接头。 连接以后就正式开始桥式PCR。首先进行第一轮扩增，将正向链序列补成双链。加入NaOH强碱性溶液破坏DNA的双链，并洗脱。留下从固定的接头上延续出来的反向链，正向链被洗脱。得到右图的第二步。 加入缓冲溶液，这时候序列自由端的部分就会和旁边的接头进行配对，形成桥状。得到右图的第三步。 进行一轮PCR，在PCR的过程中，序列是弯成桥状，所以叫桥式PCR，一轮桥式PCR可以使得序列扩增1倍。也就是右图的第四步。 然后用碱液进行解链，由于合成是各有一端是延续在接头上的，不会被洗脱。从而得到两条固定好的序列。如右图的第五步 我们一直重复第3步到第5步，就可以得到就会得到一个具有完全相同序列的簇，一般叫cluster。就是第6步 利用多个序列进行桥式PCR就会得到多个簇。 形成簇之后，加入带不同荧光标记的含有叠氮基团的dNTP和聚合酶，由于叠氮基团的存在（又称为可逆阻断终止技术），一个循环只能延长一个碱基，即一个碱基结合到测序链上为一个循环，当结合上一个碱基后，把其他dNTP和酶用水冲掉，然后进行激光扫描，根据激光扫描颜色判断是哪个碱基，根据互补原则反推出结果。再切掉叠氮基团，进入新的循环，加入新的dNTP和酶，再延长碱基，冲掉dNTP和酶，再激光扫描。如此往复，就可以测出序列的内容。如图，我们每轮读一个碱基，将每一轮的碱基按顺序组合，就可以得到待测序列了。 我们回到文中的图片。这个流动池图，就是刚才我们所说的原理，不同颜色代表不同碱基。我们根据颜色就可以读出这一轮循环所接上去的碱基。 4 / 17 说完了测序，我们回到数据分析。第一步，一般需要进行Data Cleaning。就是把从原始数据（Raw Data）到干净数据（Clean Data）的过程。Illumina测序仪下机的数据通常为Bcl格式，是将同一个测序通道（Lane）所有样品的数据混杂在一起的，所以公司一般不会提供Bcl文件。测序公司使用Illumina官方出品的Bcl2FastQ软件，根据Index序列分割转换成每个样品的FastQ文件，打开长这样：每一条序列（read）包含四行，第一行是read的ID，第二行是序列，第四行是序列中每个碱基的测序质量。 原始数据没法直接分析，是因为部分reads测序质量较低，可能会误导后续结果，因此需要对低质量碱基太多或N（未能识别的碱基）太多的reads进行去除； 此外，部分测序文库的插入片段太短，导致测到的是两侧的接头序列，这些序列接头也需要从reads中去除。最后，我们也会对清洗前后的Raw Data和Clean Data进行评估，评估内容包括碱基质量、序列长度、碱基比例、GC含量、重复序列等。一般测序公司都会提供clean data。就不详细赘述了。 然后呢，需要把测到的RNA片段，先mapping(比对)到基因组上。 这张图我们可以看到，在外显子表达的时候，由于中间有内含子存在，使得两端外显子表达之后再连接。这个带有junction site 的部分，我们再测序后称为junction reads。了解到的几种mapping方法，都是先放置non-junction reads 部分再根据对 junction reads进行处理（根据junction Library或切断为seed）。也就是我们最后看到的这样，把序列比对上基因组。 可是对于用于分析没有参考基因组和基因注释的物种，我们是没法进行比对的。所以我们需要进行序列组装。以Cufflinks软件为例。 首先，先不要看下面的三个转录本，假设只知道上面的已经比对好的reads。Cufflinks会识别这些不会出现在同一个转录本的reads即不相容。例如比较清晰的蓝色和黄色，如果在一个转录本，那么，黄色应该在相同的位置断开，而不是跨过去。如图中所示，经识别不同颜色片段两两互不相容的，同一颜色的片段， 5 / 17 彼此是相容的。 那么，通过将每个相容的片段作为节点并和它最近且相容的片段相连。就可以得到所谓的重叠图。 在此基础上，我们基于精简原则。Cufflinks在能够覆盖所有reads的路径中选择出互不相连且最少的一组路径，作为最优路径。我们怎么理解这个最优路径呢，互不相连且最少。那不符合这个原则，我们可以走出什么样的路径呢？比如这样的，这样的。路径就会变得很复杂，没有这个必要。选择最优途径，即覆盖了所以reads，又减少了不必要的重复工作。 最终呢，我们就得到了这样的三个转录本集合。 我们可将序列组装想像成从大量片段的文字中拼凑出一整篇文章的过程：被测序的分子就是那篇文章，而测序片段就是那段文章中，随机切取出来的句子。其中一种重建出这段文章的方式，就是找到句子中重叠的部分，因为一旦找到够多重叠的部分，我们就有机会将每个句子连接到一起，进而得到原始的文章。 好了，说完组装之后呢，我们回到这个数据分析。 那么在比对或者是组装完了之后，可以先看一下，有多少的RNA片段，是在靠近基因的5'端的位置，又有多少片段在是靠近基因的3'端的位置。 那么这张图上，就是把所有的基因，都按其外显子的长度，拉直。然后来看，比对上的片段。 这样一个比对的结果，就可以让我们看见前面Poly(T)磁珠在抓mRNA的时侯。捕获下来的这些mRNA是不是完整的，如果捕获下来的这些mRNA大部分是完整的话，那么这个图形靠近5'端的曲线就会显得比较饱满。它的高度会和3'端的高度差不多。 6 / 17 反之，如果这根曲线的3'端是很高的，而5'端是比较低的，我们就可以初步判断，这个RNA有一定程度的降解。 因此，我们可以推断在捕获过程当中，有相当一部分（mRNA），它的5'片段因为与3'片段的Poly(A)片段的尾巴断开了，所以，没有被捕获下来。所以，这个RNA，是有一定程度降解的。 在知道了测序的质量之后，接下大家来要关注的就是不同样本之间、各个基因的mRNA的表达量的差异。 在做这些比较的过程当中，目前最常用的，对基因表达量进行相对定量的一个指标（也叫归一化方法），就是RPKM值。那么RPKM，是Reads Per Kilobase of exon model perMillion mapped reads的英文的首字母缩写。 大概意思就是每一百万条可以比对到基因组上的，Read当中，有几条是可以比对到某个特定基因的，这个数值再除以该基因的外显子的长度，得到的这样一个最终的比值。好，再来一遍，每一百万条比对到全基因组的read中，有几条可以比对到特定基因上面去。几条这个数值再除以该基因的外显子的长度，得到一个最终的比值。 基本构成我们是知道了，那我们接下来，在详细的分步地对这个公式进行一下解释。 首先，就是比对到某个基因的外显子上的Read数，去除以这次所测到的、全部可以比对到基因组上的Read数。这个比较容易理解就是：这个基因所表达出来的mRNA它所被测到的片段，来和所有被测到的、可以Mapping(比对）到基因组上的片段来进行比较。这个的意义是什么呢？因为在是随机抽样的情况下，可以认为这个mapped到特定转录本的read数正比于该基因（也就是特定转录本）的表达量，那么我们就可以得到该特定基因的表达量在总表达量中的占比。 这点是比较容易理解的。 7 / 17 那么比较费解的是，为什么还要除以第二项，就是“除以这个外显子的长度”。这是因为建库过程当中，RNA被打断（并逆转录）成若干个180-200BP左右的小片段，如果一个基因的长显子越长，那么它所产生的mRNA就越长，那么mRNA越长，被打出来的小片段就越多，那么它的read数就越多。 我们来假设，一个A基因，它的mRNA的长度，假设它是500bp，那么它的mRNA可能被打成2 个，200Bp左右的小片段；还有一个B基因，如果这个B基因的mRNA是200bp长，那么它刚好就是自成一个200bp的小片段。 我们来看，A基因是2个小片段，而B基因是1个小片段，所以，A基因在测序过程当中，它被测到的概率就会比B基因整整大出去一倍。那当我们检测到时，就可能会认为A基因的表达量是B基因的2倍。那么结合我们之前的公式来看，我们的mapped read读数也就是分子的确是A是B的两倍。 但其实我们知道这是不对的，我们可以看出，他们的表达量是一样的，只是A基因比较长。这就是我们为什么要把刚才第一项比出来的比值，然后再除以这个外显子的长度。通过上面的解释，我们就可以理解：除以这个外显子的长度，它的目的，是修正这个mRNA长度所引起的mRNA的Read数的偏差。 通过这种修正，就能够还原出一个比较真实的、原始的表达拷贝数状态。 这个，就是“RPKM”指标的原理。 那么作为一种针对全转录组的分析，我们希望是一次看到一个整体的样本（表达）差异的情况。而不仅仅是看少数几个基因的表达差异。 所以，科学家做了一种叫“火山图”的一个图形，来比较形象地来说明样本之间的表达差异。 那么我们来看这张图。 看最上面，我们知道对照样本为ALD，检测样本为ABF。然后，我们先明确一下。在差异表达火山图中的每一个点，都表示一个基因。一个什么样的基因呢？就是

Illumina二代测序原理

概述

Illumina二代测序技术，也被称为高通量测序或次代测序，是一种基于串联测序-by-synthesis原理的DNA测序技术。该技术具有高通量、高准确性和相对低成本的优点，已成为当前最常用的测序平台。

原理详解

文库构建

Illumina测序的第一步是将待测DNA样本进行文库构建。在文库构建过程中，首先将待测DNA样本打断成随机长度的片段。接下来，对这些片段进行末端修复，添加测序接头。然后，将修复和连接的DNA片段PCR扩增，得到成千上万个文库分子。

桥PCR

经过文库构建后，接下来是进行桥PCR（bridge PCR）扩增。在这一步中，文库分子被固定在玻璃芯片或磁珠上，并进行PCR扩增。当PCR进行到一定程度时，每个文库分子形成一个桥状的扩增产物，其中每个桥上都有大量的相同DNA片段。

测序by synthesis

当桥PCR完成后，进入了测序by synthesis的阶段。此阶段利用DNA聚合酶和碱基链终止剂，通过循环的碱基加入、荧光标记和信号检测来实现。

1. 首先，引入一种碱基，如dNTP（去氧核苷三磷酸），在DNA链上与待测DNA模板的酸性序列互补匹配。这种碱基dNTP中附带荧光标记，每个dNTP的荧光颜色不同。

2. 当酶(dNTP）与模板DNA找到互补配对时，酶将附带的荧光标记dNTP连到DNA链上，并释放出一些荧光。

3. 进行光子检测，通过检测荧光沉淀来确定加入的碱基是哪一种。经过激光激发，荧光信号被感应器探测到并转化为数字信号。 4. 完成一个碱基的测序后，该碱基上的保护基团被去除，保持单链DNA完整。接下来，再次重复以上步骤，加入下一个碱基。

数据分析

测序得到的数据是原始的碱基荧光信号，需要进行数据分析以得到最终的测序结果。数据分析的主要步骤包括： 1. 信号处理和图像分析：根据荧光信号强度和强度变化，将其转换为数字序列。 2. 序列拼接：对所有文库分子的碱基序列进行拼接，得到完整的DNA片段。 3. 基因组比对：将拼接后的序列与参考基因组进行比对，寻找匹配的部分。 4. 变异位点检测：通过比对结果，检测拼接后的序列与参考基因组之间的差异。