自噬对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响

．６３６．　安徽医药Ａｎｈｕｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２０１５　Ａｐｒ；１９（４）　自噬对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响　高灵素，虞国慧　（安徽省六安市人民医院，安徽六安２１５００４）　

摘要：目的探讨自噬（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）对正常培养多发性骨髓瘤（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｙｅｌｏｍａ，ＭＭ）细胞株增殖的影响。方法ＭＭ细胞株　Ｕ２６６在正常培养条件下分别加入雷帕霉素和３一甲基腺嘌呤（３－ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ，３－ＭＡ），以正常血清培养Ｕ２６６细胞及淋巴瘤　Ｊｕｒｋａｔ细胞株为对照组；分别检测细胞的增殖及凋亡水平；单丹磺酰尸胺（ｍｏｎｏｄａｎｓｙｌｃａｄａｖｅｒｉｎｅ，ＭＤＣ）荧光染色法检测细胞自　噬水平；逆转录ＰＣＲ检测自噬相关基因ｍｔｏｒ、Ｂｅｃｌｉｎｌ、ＡｔＳ５在细胞内水平，蛋白质印迹法检测细胞内自噬相关蛋白轻链３Ｉ／１Ｉ　（ＬＣ３Ｉ／Ⅱ）含量。结果Ｕ２６６细胞及Ｊｕｒｋａｔ细胞内均存在自噬，但前者水平高于后者。雷帕霉素可诱导ＭＭ细胞发生自噬，　３－ＭＡ对自噬有双重作用。雷帕霉素及３－ＭＡ下调细胞增殖水平。雷帕霉素及３－ＭＡ处理２４　ｈ可上调正常培养条件下Ｕ２６６　细胞凋亡水平（１．７％±０．２％，１９．１％±１．０％和１６．８％±０．６１％）。延长培养时间至７２　ｈ，雷帕霉素处理组凋亡水平无明显　变化（１６．９％－Ｌ－０．４８％）。而３－ＭＡ处理组凋亡水平下降（９．０％±０．７０％）。结论ＭＭ细胞株内会存在一定水平的自噬，并　通过实验证明其高于淋巴瘤Ｊｕｒｋａｔ细胞株的自噬水平。在正常培养条件下加人了雷帕霉素及３－ＭＡ可抑制ＭＭ细胞的增殖，　并可诱导细胞凋亡。　关键词：多发性骨髓瘤；雷帕霉素；３一甲基腺嘌呤；自噬；细胞凋亡　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９—６４６９．２０１５．０４．００６　

Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｙｅｌｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ＧＡＯ　Ｌｉｎｇ－ｓｕ．ＹＵ　Ｇｕｏ—ｈｕｉ　（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｌｕ＇ａｎ　Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｕａｎ，Ａｎｈｕｉ　２１５００４，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｙｅｌｏｍａ（ＭＭ）ｃｅｌｌｓ　ｕｎｄｅｒ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｕｌ—　ｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｙｅｌｏｍａ（ＭＭ）ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ｕ２６６　ｗａｓ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｏｒ　３－ＭＡ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｎｏｒｍａｌｌｙ　ｅｕｌ－　ｔｕｒｅｄ　Ｊｕｒｋａｔ　ａｎｄ　Ｕ２６６　ｃｅｌｌ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｗｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｏｎｏｄａｎｓｙｌ—　ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ（ＭＤＣ）ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗａｓ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ＰＣＲ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｒｏＴＯＲ，Ｂｅｃｌｉｎｌ，Ａｔ　ｌｅｖｅ１．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｗａｓ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＬＣ３１／ＬＣＩＩ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｌｅｖｅｌ　ｉｎ　Ｕ２６６　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　Ｊｕｒｋａｔ　ｃｅｌｌｓ．Ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｉｎ　Ｕ２６６　ｃｅｌ１．３－ＭＡ　ｓｈｏｗｅｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｆｏｒ　ａ　ｓｈｏｒｔ　ｔｉｍｅ．Ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｏｒ　３－ＭＡ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｄｕｃｅ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｗｈｅｎ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　２４　ｈｏｕｒ　ｆ　１９．１％±１．０％　ａｎｄ　１６．８％±０．６１％，ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　１．７％±０．２％）．Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｔｏ　７２　ｈｏｕｒｓ，ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｒａｐａｍｙｃｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ｈａｄ　ｎｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（１６．９％±０．４８％）．Ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　３－ＭＡ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（９．０％±０．７０％）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｂａｓｉｃ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｉｎ　ＭＭ　ｃｅｌｌ，ａｎｄ　ｉｔ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｊｕｒｋａｔ　ｃｅｌｌｓ．Ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ａｎｄ　３－ＭＡ　ｂｏｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｙｌｏｍａ；ｒａｐａｍｙｃｉｎ；３一ＭＡ；ａｕｔｏｐｈａｇｙ；ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．　

多发性骨髓瘤（ＭＭ）是造血系统恶性肿瘤，异　常的浆细胞能分泌大量异常的单克隆免疫球蛋　白…，正常途径难以降解异常克隆的免疫球蛋白，　异常Ｍ蛋白会聚集在细胞的内质网内。能诱导细　胞内产生未折叠蛋白反应（ＵＰＲ），即大量未折叠或　错误折叠的蛋白在内质网产生，进而会导致细胞死　亡。诱导细胞自噬（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）则是ＭＭ细胞保护　其免受未折叠蛋白影响的重要途经之一ｌ２　Ｊ，本研　究观察体外经自噬诱导及阻断剂作用后ＭＭ细胞　增殖能力的变化，并检测自噬相关调节基因的变　

通信作者：虞国慧，女，主任医师，研究方向：血液疾病，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｇｕｏ－　ｈｕｉ５８８７＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ　

化，从不同角度探讨ＭＭ的发病机制。　１材料和方法　１．１细胞株来源及细胞分组本实验使用细胞株　均由苏州大学邱玉华教授惠赠；实验过程中，Ｕ２６６　细胞随机分为正常培养细胞组、雷帕霉素处理组、３　ＭＡ处理组，对照组如下：无血清培养条件下的　Ｕ２６６细胞组、无血清培养条件下雷帕霉素处理　Ｕ２６６细胞组、无血清培养条件下３．ＭＡ处理Ｕ２６６　细胞，正常培养和无血清条件下培养的Ｊｕｒｋａｔ细胞。　雷帕霉素和３－ＭＡ药物浓度均为１　０００　ｇ・Ｌ～。　１．２　ＣＣＫ８法检测细胞活力　调整细胞密度为２　ｘ　１０　・Ｌ。。，接种于９６孔培养板，立即加入１０　Ｌ　ＣＣＫ．８试剂，后分别间隔２４　ｈ加入ＣＣＫ．８试剂，直　安徽医药Ａｎｈｕｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２０１５　Ａｐｒ：１９（４）　．６３９．　３讨论　多发性骨髓瘤细胞是一种恶性浆细胞病，其肿　瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，其特征为骨髓浆细　胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链（Ｍ蛋　白）过度生成，极少数患者可以是不产生Ｍ蛋白的　未分泌型ＭＭ。在一般情况下细胞内存在的异常蛋　白能导致细胞死亡，细胞能通过多种途径降解蛋　白，研究发现自噬具有降解异常蛋白的能力。自噬　可以降解胞内堆积的毒性蛋白质，故而我们推断自　噬是维持多发性骨髓瘤细胞发生、发展的重要因　素。已有研究证实抗肿瘤药物通过自噬途径起作　用　。但同时研究发现，自噬对细胞的生存和增殖　起到不利的作用，过度的自噬能导致细胞死亡＿５　Ｊ。　研究资料发现，Ｈｏａｎｇ等研究了ＭＭ细胞株中　的自噬情况，结果表明其中存在一定水平的自噬现　象　Ｊ，当细胞暴露于蛋白酶体抑制剂硼替佐米、受　到内质网应激，或用ｍＴＯＲ抑制剂处理时，细胞内　的自噬水平会上升，帮助在上述环境下维持细胞长　期生存。同样的，研究证明饥饿条件同样可抑制　ｒｏＴＯＲ蛋白的活化，进而诱导细胞自噬发生，通过对　自身细胞内各种营养元素物质的降解来维持细胞　增殖　。雷帕霉素为现有的ｍＴ０Ｒ蛋白抑制剂，研　究发现，培养液内加人雷帕霉素可诱导自噬的发　生　。同时研究发现，自噬过程中有Ｉ／ｍ型磷脂　酰肌醇３磷酸激酶系统参与。３－ＭＡ可通过抑制Ⅲ　型磷脂酰肌醇３磷酸激酶（ｃｌａｓｓⅢＰＩ３Ｋ）来抑制自　噬的发生，所以该药物广泛作为自噬抑制剂使用。　然而又有研究发现，如果在正常培养条件下延长３一　ＭＡ和骨髓瘤细胞的作用时间，其自噬水平反而呈　明显上调状态¨…。这可能是由于３．ＭＡ同时对Ｉ型　ＰＩ３Ｋ系统也有抑制作用，起到诱导自噬的作用。故　３－ＭＡ对自噬起到抑制及诱导的双重作用。　多发性骨髓瘤细胞内存在基础自噬，为了研究　其对细胞增殖的作用，我们绘制了饥饿培养条件下　Ｕ２６６细胞及Ｊｕｒｋａｔ细胞的增殖曲线。结果发现在　体外饥饿条件下Ｕ２６６细胞仍具有增殖能力直至培　养７２　ｈ。而对照组Ｊｕｒｋａｔ细胞的增殖成低平曲线，　基本停止增殖；在血清培养液条件下加入雷帕霉素　及３－ＭＡ，细胞增殖水平较未加入试剂的Ｕ２６６细胞　增殖水平明显低下。　本实验研究了ｍｔｏｒ、Ａｔｇ５及Ｂｅｃｌｉｎｌ基因在　Ｕ２６６细胞内的表达。雷帕霉素可上调细胞内自噬，　而３－ＭＡ在处理２４　ｈ时对自噬起到抑制的作用，到　培养７２　ｈ，检测自噬相关基因表达我们发现示３一　ＭＡ反而对自噬起到诱导作用。这就证明了培养时　

间延长到一定程度，３－ＭＡ对Ｉ型磷脂酰肌醇３磷酸　激酶系统的抑制起主导作用，诱导自噬发生。Ｂｅｃ—　ｌｉｎｌ蛋白是Ⅲ型磷脂酰肌醇３磷酸激酶系统的组成　部分，故Ｂｅｃｌｉｎｌ基因与Ａｔｇ５基因相比，３－ＭＡ处理　组培养２４及７２　ｈ后Ｂｅｃｌｉｎｌ基因表达水平均较正　常培养及雷帕霉素处理组低。故而我们可以得出　结论，提示在培养过程中３－ＭＡ对Ⅲ型ＰＩ３Ｋ系统的　抑制作用一直存在，故而导致Ｂｅｃｌｉｎｌ基因表达水　平下降。　虽然我们的实验发现正常培养条件下雷帕　霉素及３－ＭＡ对细胞内自噬的影响不同，但多发　性骨髓瘤细胞的增殖曲线为相同趋势。故可推　测过度诱导自噬及抑制自噬均可能造成细胞死　亡，抑制细胞增殖。接下来本实验研究细胞内凋　亡水平。　自噬与凋亡均属于程序性细胞死亡范畴，但越　来越多的研究发现二者在某些情况下存在着联　系　ｊ，有着相互协同发展或拮抗的作用。本实　验发现雷帕霉素及３一ＭＡ处理２４　ｈ后骨髓瘤细胞　内内凋亡水平均升高。但是到培养７２　ｈ时，３．ＭＡ　处理的细胞组内凋亡水平较培养２４　ｈ时下降。表　明培养时间延长，培养液内营养物质逐渐降解，接　近饥饿环境，３－ＭＡ通过对抗细胞凋亡来延长细胞　生存。　综上所述，自噬可促进ＭＭ细胞增殖，并维持　其长期生存，但自噬抑制剂、阻断剂如雷帕霉素及　３．ＭＡ也可同时抑制ＭＭ细胞增殖，促进细胞凋亡。　证实自噬对ＭＭ细胞生存具双重作用，或双向调节　左右，有必要进一步深入探讨，可能对多发性骨髓　瘤的治疗提供新的治疗靶点。