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皮肤组织显微共聚焦拉曼光谱成像研究

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第25卷第5期 2016年10月激光生物学报ACTA LASER BIOLOGY SINICAVol. 25 No. 5 Oct. 2016doi：10. 3969/j. issn. 1007-7146. 2016. 05. 002皮肤组织显微共聚焦拉曼光谱成像研究尹亚宁\王爽lb，龚宇泽' 郑继明lb，秦杰2,梁卓文3,贺庆丽'(1.西北大学a.物理学院；b.光子学与光子技术研究所，陕西西安710069;2.西安交通大学第二附属医院，陕西西安710004; 3.中国人民解放军第四军医大学西京医院骨科，陕西西安710032)摘要：显微共聚焦拉曼光谱成像技术（Confocal Raman Microspectroscopy Imaging, CRMI)能够对样品微区进 行精确无损的拉曼光谱分析和光谱图像扫描，提供生物样品的无损高分辨光学信息。本项研究工作，利用CR- MI技术实验获取了正常人体离体皮肤组织的拉曼光谱特征，并结合典型特征峰的扫描图像，探讨了脂类、蛋白 质等成分在皮肤真皮层的分布特点。实验发现皮肤组织真皮层内胶原蛋白的拉曼特征峰1 248 cm1强度及其空 间分布尤为突出，这一实验结果与组织学中胶原纤维占真皮结缔组织95%的事实相符。实验结果显示，CRMI 技术能够全面诠释生物组织内部生化组成与分布信息，在实验描述皮肤组织病理变化的分子生物学机制方面 具有广阔的应用前景。关键词：共聚焦拉曼光谱成像技术；皮肤组织；拉曼光谱；拉曼图像 中图分类号：Q631 文献标志码：A文章编号：1007-7146(2016)05~0391-07A Study on Biochemical Constitution of Human Skin Tissue by ConfocalRaman Microspectroscopy ImagingYIN Yaning1 , WANG ShuangU , GONG Yuzeia , ZHENG Jiminglb, QIN Jie2 , LIANG Zhuowen , HE qinglila(1. Northwest University a. Department of Physics； b. Insitute of Photonics and Photon-Technology,Xi’ an 710069，Shannxi, China； 2. Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Xi, an Jiaotong University, Xi’ an 710004，Shannxi, China； 3. Department of Orthopaedics, Xijing Hospital of Fourth Military Medical University, Xi( an 710032, Shannxi, China)Abstract ： Confocal Raman Microspectroscopy Imaging (CRMI) provides a precise tool to illustrate biochemical nature and structure of biological tissue without introducing any external labels. It enables a high-contrast and high-resolution imaging of molecular composition by reconstructing selected Raman bands of each spectrum obtained from every scanning points on the sample. In this work, CRMI was utilized to investigate Raman features of ex vivo human normal skin tis­sue ,and visualize the lipids and protein distribution pattern in skin dermis layer. The acquired spectral data showed that the prominent spectral features is the major vibration bands around 1 248 cm 1 assigned to collagen content in dermis， which have a good correlation with skin histology fact that collagen fiber account for 95% of the dermal connective tis­sue. The achieved results exhibit that spectra-structure correlation can be clearly addressed by tissue biochemical profiles收稿日期=2016-03-30;修回日期：2016~05-19基金项目：国家自然科学基金青年项目（No. 11404258);国家自然科学基金青年项目（No. 81401018);陕西省自然科 学基础研究计划项目（N。. 2014JQ1011);陕西省教育厅专项（N。. 14JK1743);陕西省教育厅重点科研计划 项目（No. 15JS102)作者简介:尹亚宁（1992 -)，女，陕西榆林人，硕士研究生，主要从事共聚焦拉曼光谱成像技术方面的研究。（电子邮 箱）yinyaning5 @ 163. com*通讯作者：贺庆丽（I960 -)，女，教授，博士，主要研究方向为生物光学。（电子邮箱）heqingli@nwu. edu.

cn392激光生物学报第25卷with CRMI method. The results also indicate that CRMI have a potentially broad application on studying molecular patho­genesis in skin diseases.Key words ：confocal raman microspectroscopy imaging； skin tissue； Raman spectrum； Raman image.〇引言人射激光激励被测分子体系时，发生能量交换， 产生与人射光频率不同的散射光，即为拉曼散射效 应。通过分析拉曼散射光谱的特征峰位置及其频 移，能够获得被测样品的分子结构与生化组成信 息[1]。通过照明光阑针孔与光电检测光阑针孔互为 共轭构成显微共聚焦光路，并将其引人到拉曼光谱 的探测与分析中，就形成了显微共聚焦拉曼光谱成像技术（confocal raman microspectroscopy imaging, CR-MI)[2]。CRffl技术将拉曼光谱分析与光学共聚焦 成像有机融合，在不破坏样品的条件下，获取每一个 像素内完整的光谱信息，并最终构造出以样品生物 结构和化学组分为基础的光谱图像。这一技术，不 但能够全面直观地呈现生物样品化学成分组成与分 布特征，而且能提供物质的结构、键力和物性参量等 空间分布信息，尤其适用于生物组织病理特性分 析[3]。CRMI已被广泛应用于复杂生物样品如活细 胞、生物组织的化学分析，并用于监控细胞和亚细胞 水平的化学组成及其病变机制问题的研究工作[4~。皮肤由蛋白质、核酸、糖、辅酶等成分组成，是人 体表面积最大的器官，主要作用是保护体内器官和 组织不受物理、化学、病原体等的影响[7]。皮肤组织 由表皮、真皮、皮下组织组成，还包括一些附属器官 (汗腺、皮脂腺、指甲）、血管、淋巴管、肌肉等[7]。各 层组织、细胞形态和生物功能各不相同，但其含有相 同类型，不同拉曼光谱特征的生物分子。在实验中， 通过研究各层皮肤组织的拉曼光谱特征，能够描述 不同皮肤层中所具有的化学组分差异。例如，角质 层和表皮层之间主要光谱差异表现在1 〇62、1 126、 1 296 cm1处，表明了大量神经酰胺分布于角质层 中[8]。相比于拉曼光谱分析技术，CRMI技术研究离 体皮肤组织的拉曼光谱特性，将大量含有分子化学 成分组成信息的拉曼光谱浓缩为高信息内涵的光谱 图像，能够更为直观地呈现皮肤组织内部不同的化 学成分，以及其相对含量差异，更有利于归纳分析皮 肤组织内部的生化组成特性。1实验1.1样品制备本实验所使用的人体皮肤组织样品购买于西安 艾莉娜生物科技公司，已通过伦理委员会的审查并 符合HIPAA法案的相关要求，能够用于实验研究。 脸部外科手术后，将切下的皮肤组织立刻使用液氮 冷却保存。在-20 °C的温度下，使用切片机垂直切 下厚度为20 |xm的切片，并将其直接固定在镀金玻 璃载片上用于实验分析。相比于常用玻璃载片，镀 金载玻片不但可以有效消除可能来自基底荧光背景 信号，而且可以显著增强样品拉曼散射信号强度[9]。 在使用前，冰冻切片样品保存在-80 °C超低温冰箱 中，自然升温至室温后用于光谱分析实验。1-2实验仪器本项研究工作，主要使用Alpha500R显微共聚 焦拉曼光谱成像系统（WITec GmbH, Germany)进行 实验研究（如图1所示）。使用633 nm激光器（35 mW@ 633 nm，Research Electro-optics, Inc.，USA)作 为激发光源。直径为10 |xm的单模光纤将激发光源 与正置显微镜相连接，使用63 x物镜作为拉曼光谱 激发与收集物镜。样品置于多轴压电扫描台（扫描 范围为 200 jxm X 200 jxm X 2 jxm，准确度为 4 nm X 4 nm x0. 5 nm，线性度优于 0. 02%，P-524K081，PI GmbH, Germany)上。压电扫描台下方安置了一个三 维微米位移台，以实现样品大范围光谱测量与分析 (200 jxm x200 jxm x 200 jxm-150 mm x 150 mm x 100 mm) [9]。激光照射样品后发生拉曼散射，散射光子 被物镜收集，然后经过一个全息滤波器处理，再通过 直径为50 |xm的多模光纤传送到光谱仪（UHTS300, WITec GmbH, Germany,光谱分辨率 <0.5 cm—。。光 谱仪包含600和1 200线两个光栅结构、600 x 200 背感光深度制冷电子倍增型CCD(测量时间低至12 ms)。研究过程中，通过测量标准硅片的拉曼光谱实 现波长校准，并使用标准钨灯（RS-3, EG&G Gamma Scientific，U S A)对系统的光谱响应进行校准。1.3数据处理实验获得的皮肤样品光谱数据，除具有拉曼光 谱信息外，还包含了一定量的样品荧光背景与环境 辐射噪声。正是由于受到背景噪声的影响，光谱测 量结果表现为谱图上的波动和毛刺[w]。由于皮肤 组织拉曼特征峰主要集中在800-1 800 cm4范围，因 此在实验测得原始光谱数据后，使用WITec

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拉曼成像 质谱成像

拉曼成像 质谱成像

1 拉曼成像 质谱成像

拉曼成像和质谱成像都是高端显微成像技术，它们在科学研究和医学诊断等领域有着广泛的应用。下面分别介绍这两种技术：

1. 拉曼成像（Raman Imaging）

拉曼成像是一种基于拉曼效应的显微成像技术。拉曼效应是指当光线穿过样品时，样品中的分子会与光发生相互作用，散射出不同频率的光。这些散射光的频率与分子的振动模式有关，因此可以通过分析散射光的频率来获取样品的分子信息。

拉曼成像可以提供高分辨率的化学成像，用于观察生物样本中的分子分布和化学变化。它特别适合于无标记的活细胞和组织的成像，因为拉曼成像不需要使用荧光标记，因此对样品的影响较小。

2. 质谱成像（Mass Spectrometry Imaging）

质谱成像是一种利用质谱技术来获取样品空间分布信息的方法。质谱是一种分析技术，通过将样品中的分子分解成离子，然后根据离子的质量和电荷来分析分子的组成。

在质谱成像中，离子化器将样品中的分子转化为离子，然后通过质谱仪进行分析。通过扫描样品表面，可以获得分子在不同位置的质量和电荷信息，从而得到分子的空间分布。

质谱成像可以提供高灵敏度和高分辨率的化学成像，特别适合于分析复杂样品中的多种分子。它已被广泛应用于生物医学研究，如蛋白质组学、代谢组学和药物研发等领域。

总的来说，拉曼成像和质谱成像都是强大的显微成像技术，可以 2 提供关于样品分子组成和分布的详细信息。它们在科学研究和医学诊断中都有着重要的应用价值。

激光共聚焦拉曼显微镜检测标准

激光共聚焦拉曼显微镜检测标准

激光共聚焦拉曼显微镜检测标准

在现代科学研究中，激光共聚焦拉曼显微镜（以下简称激光拉曼显微镜）已经成为一种常用的分析工具。激光拉曼显微镜通过激发样品中的化学键振动，可以获得关于样品成分、结构和性质的信息，具有高灵敏度和高分辨率的特点。然而，由于激光拉曼技术的复杂性和多样性，制定相应的检测标准显得尤为重要。

1. 激光拉曼技术的基本原理

激光拉曼技术是一种非破坏性的光谱分析方法，通过使用激光和光谱仪来探测样品的分子振动信息。当激光与样品相互作用时，部分光子被散射，而其余光子则会发生拉曼散射，从而获得特定频率的振动能级信息。激光拉曼显微镜结合了共聚焦技术，可以实现光学显微镜和拉曼光谱仪的双重功能，不仅能够获得高分辨率的成像，还可以获得高灵敏度的拉曼光谱信息。

2. 制定激光拉曼显微镜检测标准的重要性

由于激光拉曼技术的复杂性和多样性，制定相应的检测标准变得至关重要。标准化的检测流程和方法可以保证实验数据的可靠性和准确性，同时也有利于不同实验室和研究机构之间的结果比对和交流。制定检测标准还可以促进技术的进步和应用的普及，推动激光拉曼技术在不同领域的应用。

3. 激光拉曼显微镜检测标准的制定内容

激光拉曼显微镜检测标准应包括样品制备、仪器校准、数据采集和分析等多个方面。在样品制备方面，应该明确样品的准备方法、存放条件和处理步骤，以确保实验的可重复性和可比性。仪器校准也是非常重要的环节，需要制定相应的校准方法和标准物质，以保证激光拉曼仪器的准确性和稳定性。对于数据采集和分析，应该规定数据的采集参数、处理方法和结果解释的标准流程，以确保实验结果的可靠性和准确性。

4. 个人观点和总结

在我看来，制定激光拉曼显微镜检测标准是非常必要的，可以保证激光拉曼技术在科研领域的可靠性和准确性。我认为，在制定标准的过程中，应该充分考虑实际应用的需求和特点，同时也应该借鉴国际标准和先进经验，以期制定出通用、实用和可操作的检测标准。

拉曼光谱实验注意事项

拉曼光谱实验注意事项

拉曼光谱实验注意事项

一、样品准备

在进行拉曼光谱实验前，需要充分了解样品的性质和特点，以便选择合适的实验条件和样品处理方式。以下是一些需要注意的事项：

1. 样品应具有代表性，能够反映所研究对象的特征或性质。

2. 对于不透明的样品，需要将其表面打磨或抛光，以便激光能够穿透样品并获得清晰的拉曼光谱。

3. 对于液体样品，需要将其稀释至一定浓度，以便在拉曼光谱中获得清晰的信号。

4. 对于气体样品，需要确保样品纯净且无杂质，以免干扰拉曼光谱的测量结果。

5. 对于固体样品，需要将其固定在样品台上，以确保其稳定性和可靠性。

二、实验环境

拉曼光谱实验需要在一定的实验环境下进行，以确保实验结果的准确性和可靠性。以下是一些需要注意的事项：

1. 实验室应保持干燥、清洁、无尘，避免样品受潮、污染或损坏。

2. 实验室的温度和湿度应保持恒定，以确保仪器的稳定性和可靠性。

3. 实验室内应避免强光直接照射仪器和样品，以免干扰实验结果。

4. 实验室内应保持安静，避免噪音干扰实验结果。

5. 实验室内的电源和接地应符合仪器要求，以确保仪器的正常运行和安全。 三、激光安全

拉曼光谱实验中使用的激光具有较高的能量和亮度，需要注意激光安全问题。以下是一些需要注意的事项：

1. 实验时应佩戴合适的防护眼镜或防护面罩，以避免激光直接照射到眼睛或面部。

2. 实验时应避免激光照射到皮肤或衣物上，以免造成损伤或烧伤。

3. 实验时应保持仪器整洁、干净，避免激光照射到灰尘或其他污染物上，以免造成火灾或爆炸等安全事故。

4. 实验时应严格按照仪器操作规程进行操作，避免误操作导致激光能量过高或过低等不安全因素。

5. 实验时应定期检查仪器的安全性能和防护措施，确保其正常、可靠地运行。

四、仪器校准

拉曼光谱实验中使用的仪器需要进行定期校准和维护，以确保实验结果的准确性和可靠性。以下是一些需要注意的事项：

1. 仪器应定期进行校准和维护，以确保其正常、可靠地运行。

激光共聚焦拉曼光谱

激光共聚焦拉曼光谱

激光共聚焦拉曼光谱

激光共聚焦拉曼光谱（LCLS）是最新的拉曼光谱技术，能够进行三维化学成像，具有高灵敏度和非破坏性等优点。在化学、生物、医疗及环境科学等领域具有广泛的应用。

LCLS技术的特点在于它能够将样品的一部分作为激光聚焦点，获得样品内部和表面化学成分的信息，同时得到每层的深度信息。这些信息有助于研究物质的微结构和分子之间的作用。与传统的拉曼光谱相比，LCLS具有更高的信噪比和更高的分辨率，使得LCLS成像技术可以用于复杂的样品分析。

LCLS的工作原理是采用注入样品的激光束在表面聚焦，激光所照射到的小区域是激光的焦点，激光聚焦区域内，分子振动将会不同于其它区域，这些振动频率的变化就是所谓的拉曼散射。由于激光聚焦的能力，LCLS可以获取重要的样品化学成分信息，这种技术被称为三维化学成像。

LCLS的应用非常广泛，特别是在材料科学和生命科学领域，LCLS技术可以用于表面化学组成分析。在生命科学领域，LCLS技术可以应用于单细胞成像，有效地提高了样品的分析效率。在生物医学中，LCLS还可以用于研究癌症细胞的成长过程，解析细胞内部的复杂化学反应。

LCLS的优点在于速度快，可以在短时间内获取大量的化学信息。同时还具有非破坏性，因此不会对样品造成损伤或污染。近年来，LCLS技术已经开始得到广泛的应用，在化学和生命科学等领域展现出了强大的分析能力。

总之，LCLS是一种高分辨率的三维化学成像技术，它在化学、生物、医疗和环境科学等领域有着广泛的应用。其优点包括高速度、非破坏性和高灵敏度，因此可以持续地进行大量的化学分析。未来，随着LCLS技术不断完善，它将为科学家解开更多的谜团。