G 蛋白耦联受体下调机制的最新研究进展

细 胞 生 物 学

课 程 论 文

题 目 G 蛋白耦联受体下调机制的

最新研究进展

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G 蛋白耦联受体下调机制的最新研究进展

摘要 众所周知,神经递质和神经调质主要通过与G 蛋白耦联受体( G protein coupled

receptors, GPCRs) 结合发挥生理功能。而G 蛋白耦联受体则通过调控与鸟嘌呤核苷结合的异源三聚体GTP 蛋白家族的转换来调解信号传导。本文总结了神经细胞或非神经细胞内激动剂诱导的GPCRs 下调的多样化、高度保守机制的研究, 阐述了GPCRs下调的蛋白分解机制的最新进展。

关键词 G 蛋白质类 基因 调节 溶酶体 水解作用

1 前言

三聚体GTP结合调节蛋白（trimeric GTP-binding regulatory protein）简称G蛋白，位于质膜胞质侧，由α、β、γ三个亚基组成，α 和γ亚基通过共价结合的脂肪酸链尾结合在膜上，G蛋白在信号转导过程中起着分子开关的作用，当α亚基与GDP结合时处于关闭状态，与GTP结合时处于开启状态，α亚基具有GTP酶活性，能催化所结合的ATP水解，恢复无活性的三聚体状态，其GTP酶的活性能被RGS（regulator of G protein

signaling）增强。RGS也属于GAP（GTPase activating protein）。G蛋白耦联型受体为7次跨膜蛋白，受体胞外结构域识别胞外信号分子并与之结合，胞内结构域与G蛋白耦联。通过与G蛋白耦联，调节相关酶活性，在细胞内产生第二信使，从而将胞外信号跨膜传递到胞内。G蛋白耦联型受体包括多种神经递质、肽类激素和趋化因子的受体，在味觉、视觉和嗅觉中接受外源理化因素的受体亦属G蛋白耦联型受体。而G 蛋白耦联受体则通过调控与鸟嘌呤核苷结合的异源三聚体GTP 蛋白家族的转换来调解信号传导。典型的GPCRs信号转导包括, 在质膜上GPCR 和G 蛋白依赖于激动剂发生相互作用, 并与效应器耦联产生可溶性的第二信使或离子流。而信号转导的终止归因于G 蛋白耦联受体激酶( GRK) 和 arrestin介导的受体解耦联或内化。GPCRs 受多种途径调控,这种调控在信号的传导过程中起着重要作用。本文总结了神经细胞或非神经细胞内激动剂诱导的GPCRs 下调的多样化、高度保守机制的研究, 阐述了GPCRs 下调的蛋白分解机制的最新进展。

2 G 蛋白耦联受体的结构和功能特点

G蛋白偶联型受体是具有七个跨膜螺旋的受体，在结构上面它包括七个跨膜区段，它们与配体结合后，通过与受体偶联的G蛋白的介导，使第二信使物质增多或减少，转而改变膜上的离子通道，引起膜电位发生变化。其作用比离子通道型受体缓慢，这类受体与G蛋白之间的偶联关系也颇为复杂；一种受体可以和多种G蛋白偶联，激活多种效应系统；也可同时和几种受体偶联或几种G蛋白与一种效应系统联系而使来自不同受体的信息集中于同一效应系统。

机体中大量的细胞外信号, 如神经递质、激素、气味和药物等等, 正是通过这类七次跨膜受体而传入细胞内的。在细胞水平上, G 蛋白耦联受体是通过与膜内侧的异源三聚体GTP GDP 结合蛋白( G 蛋白) 的耦联作用而将信号传递给下游的效应分子系统。其中, 激动剂结合G 蛋白耦联受体, 使受体与不同种类G 蛋白三聚体耦联, 催化G 蛋白亚基上结合的鸟苷二磷酸( GDP) 变为鸟苷三磷酸( GTP) 。GTP 与亚基结合引起 亚基从亚基复合物上解离。由于受体及其结合G 蛋白的不同, G GTP 亚基激活或抑制一个或更多细胞内效应酶, 导致细胞内代谢变化的多样性。如此类受体与特异性配体相互作用后, 通过G 蛋白作中继站, 耦联信息传递, 激活腺苷酸环化酶( AC) 鸟苷酸环化酶( GC)

或磷脂酶C b( PLC b) 产生cAMP、cGMP、IP3 、DAG、Ca2+ 等第二信使, 激活各自的蛋白激酶( 包括PKA、PKG、PKC、CaM PK 等) , 引起特定的蛋白质( 酶) 等底物磷酸化, 诱发各种生物学效应, 调节物质代谢或控制细胞生长和增殖。

3 受体的下调作用

在动物实验中, 通过对特异性结合于特定G 蛋白耦联受体的放射性配体的研究,

发现了GPCRs 的下调过程。有人将下调定义为质膜各部位探测到的放射性配体结合部位数目的减少, 并认为下调包括了全部受体数目的减少。

但进一步的研究表明, 受体下调是受体从细胞表面到细胞内质膜的重新分布, 而不是受体总数的减少。另有报道也提示受体下调可能是由于受体的构象改变所引起, 并未检测到有受体蛋白的损失, 而且下调的恢复依赖于新的蛋白复合体的形成。许多细胞和组织中均有G 蛋白耦联受体下调现象, 如有研究发现, 梭曼等有机磷化合物中毒大鼠脑组织与H3 QNB的结合降低, 表现为M 受体数目减少( 受体下调) 。有研究表明, 包括神经母细胞瘤和培养的神经元在内的许多不同类型细胞具有类似的GPCRs 下调机制,

而且下调的某些特征在不同的有机体内高度保留。如在酿配酵母时, 发育期酵母交配信息素的活性是由GPCR 介导的信号传递来调节的, 其中Ste2基因编码受隐藏的交配信息素 因子激活的G 蛋白耦联受体。细胞长时间与 因子孵育导致应答减弱, 可能与ste2

蛋白的水解有关。此过程则是由配体诱导的内吞作用引起的,即将Ste2 蛋白转运到vacuole( 一种类似哺乳动物溶酶体的蛋白分解细胞器) 。在其他一些详尽的研究中,

已经阐明了调控内吞作用和vacuole 作用于ste2p 受体蛋白的翻译后修饰过程。

4 哺乳动物细胞G 蛋白耦联受体的蛋白水解作用

通过亚细胞分离法、溶酶体蛋白水解作用的生化抑制以及受体的细胞免疫法定位证实, 许多哺乳动物细胞的G 蛋白耦联受体的下调与受体易位到溶酶体有关, 提示溶酶体参与了某些细胞的GPCRs 下调过程。尽管哺乳动物溶酶体与酵母空泡( vacuole) 有相似之处, 但不同有机体的GPCRs 下调的特异性机制尚不清楚。现有证据表明多种不同的非溶酶体机制也可引起哺乳动物细胞GPCRs 蛋白水解。对V2 加压素受体的研究证实,

与血浆质膜相融合的金属蛋白酶可以引起配体诱导的蛋白质水解。

对 2 AR 的研究表明, 在某些细胞中出现的交替性蛋白分解机制在其他细胞中并不出现。例如在A431 细胞( 一类表达 2 AR 和EGF 受体的细胞系) 中, 内吞作用抑制或溶酶体降解途径失活并没有阻止 2 AR 下调, 而EGF 受体降解却受到抑制。此外, 许多哺乳动物细胞受体经历过核小体表面蛋白( ubiquitn) 的修饰, 而这种修饰是受体下调所必须的。一般来说, 人们认为这种GPCR 降解的非溶酶体机制可能是由蛋白酶引起的,

有意义的是此机制对溶酶体和蛋白酶介导的蛋白质水解抑制剂并不敏感。

5 溶酶体对G 蛋白耦联受体的内吞作用

目前的研究集中在探讨哺乳动物细胞GPCRs 成为溶酶体靶目标的特殊机制。实际上,

膜蛋白从质膜到溶酶体的转移是一个由胞饮作用介导的多步过程, 并伴有内在化蛋白经特殊内吞途径进行转运。许多G 蛋白耦联受体经历了配体诱导的内吞作用, 但与G 蛋白耦联受体内在化的发生相比,受体下调多伴有快速动力学改变。DeFea 等通过应用生物化学与免疫荧光检测证实, 阿片样物质激活细胞外信号调控激酶( ERK) 时需要受体的内化。

有研究证实了GPCR 内吞作用在激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信号传导通路中的特殊作用, 传统观点认为受体内化在许多受体介导的MAPK 激活过程中起作用。但是,

也有许多研究质疑了受体内吞作用在此信号传导通路中的确切作用。使用受体内化抑制剂可以特异性阻断MAPKK( MEK) , 但质膜上受体介导的MAPK 信号途径并不受该抑制剂的影响。并提示了dynamin和dynamin 依赖的内吞作用在MAPK 激活过程中的功能。研究认为在MAPK 信号转导途径中一个重要的因素是由dy namin 调节的活性MEK 的内吞作用,

而不是受体的内化。而且对V2 加压素受体的研究表明, 内吞作用可以使GPCRs 易位至细胞内, 在那里受体可以不发生蛋白水解或再循环而稳定地潴留, 从而处于长时间的脱敏状态, 且与相伴的受体下调无关。

那么是不是不同的细胞内吞作用机制将GPCRs 在不同的膜通路间分隔? 研究证实,

将 2 AR 羧基末端4 个丝氨酸和苏氨酸残基取代可以阻止配体诱导的磷酸化、扣留和脱敏, 但这些改变并不影响受体与Gs 耦联及远期下调作用。即 2 AR 受体下调并不需要受体磷酸化或扣留, 说明传统的内吞机制与 2 AR 下调并不相适应。尽管在内吞作用中存在明显差别, 但 2 肾上腺素受体的三种亚基( 2a、 2b、 2 c) 以相近的比例下调却是自然存在的。Trejo 等研究证实: 凝血酵素G 蛋白耦联受体即蛋白酶活性受体1( PAR1) 同其他GPCRs 一样, 在激活后发生磷酸化、信号解耦联以及内化。但与经典GPCRs 发生内化和循环的不同之处是PAR1 被分检到溶酶体。野生型物质P 受体与携带有物质P 受体胞质末端的PAL1 被激活后都发生内化和再循环; 而野生型PAR1 与携带有PAR1胞质末端的物质P 受体被激活后分检到溶酶体。提示位于细胞质结构域羧基端残基对于凝血酵素和物质P 受体在溶酶体和再循环通路之间的膜转运存在差别。

6 G 蛋白耦联受体内吞作用的多样性机制

许多G 蛋白耦联受体经历了配体介导的内吞作用。这种内吞作用可以被

arrestins( 抑制蛋白) 介导的高度保守机制所促进。然而, 不同的GPCRs 在进行内吞作用的能力上存在显著差别。且有研究表明, 在GPCRs 内吞作用机制中存在着受体特异性和细胞类型特异性的差别。例如, 2 AR 在多种类型细胞中经由包涵素被覆小凹被内吞入胞, 而在部分细胞中此受体可以通过类似小窝( caveolae) 的膜内陷发生内吞作用。胆囊收缩素受体也在同种细胞被覆小凹和caveolae中被发现, 提示该受体内吞作用可经包涵素依赖途径及非包涵素依赖途径。其中前者是主要途径, 通向内涵体或溶酶体房室间隔, 并经再循环回到质膜; 后者通向邻近质膜类似空泡的光滑小泡状隔, 而不向细胞内更深处转运配体。

既往研究已经发现: 在哺乳动物细胞内, dynamin 对包涵素依赖性内吞作用以及空泡引起的内化都有调节作用。但有研究发现多种受体的内吞作用并没有被阻碍包涵素被覆小凹与空泡胞吞作用的dynamin 阴性突变体所抑制, 说明了其他机制在上述情况下对受体内吞入胞发生作用。正如Lee 等作了一项实验, 当arrestin2 或arrestin3 在转染HEKSA201 细胞中过度表达时, m1、m3 胆碱能受体的内化不受影响。而且, 当使用arrestin阴性突变体来阻断内生arrestin 功能时, 对于m1 、m2 、m3受体的内化没有变化, 而 2 AR 内化完全受阻。他们又发现:尽管dynamin 依赖的内吞作用被阻断, 血管紧张素2 受体与m2 受体在HEK293 细胞中依然发生内化。更有意义的是, 当arrstin2