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应用CRISPR Cas9基因编辑技术构建沉默 MARCH2的细胞系

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Advances in Clinical Medicine 临床医学进展, 2019, 9(4), 383-389

Published Online April 2019 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/acm https://doi.org/10.12677/acm.2019.94058

文章引用: 夏丹. 应用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建沉默MARCH2的细胞系[J]. 临床医学进展, 2019, 9(4): 383-389.

DOI: 10.12677/acm.2019.94058

Construction of MARCH2 KO Cell Line by

CRISPR/Cas9 Technology

Dan Xia

Pathology Department of Shandong Medical College, Linyi Shandong

Received: Mar. 6th

, 2019; accepted: Mar. 22nd

, 2019; published: Mar. 29th

, 2019

Abstract CRISPR/Cas9 system is the state-of-the-art genome-editing technology through constitutive ex-

pression of nucleases Cas9, which binds to a specific site in the genome mediated by single guide

RNA (sgRNA) and induces double-strand breaks (DSBs) at desired genomic loci. DSBs induced by

these site-specific nucleases can be repaired by error-prone nonhomologous end joining (NHEJ) or

homologous recombination, to generate gene-specific knockout (KO) or knock-in cells. The mem-

brane associated RING-CH (MARCH) family comprises a structurally related protein family. Cur-

rently, there are at least eleven known MARCH genes (MARCH-1–11) in the human genome.

MARCH2 is involved in the regulation of vesicle trafficking, and thus refers to the formation, intra-

cellular movement, exocytosis, and endocytosis of synaptic vesicles. In this study, two sgRNAs tar-

geting the Exon2 of MARCH2 gene were designed, and their gene targeting efficiency was assessed

via the western blot analyses. Through dilution plating, a monoclonal MARCH2 KO cell line was

isolated and subjected to the sequence analysis, which revealed that it contained frameshift muta-

tions in both MARCH2 alleles. The results obtained demonstrate the successful application of the

CRISPR/Cas9 system to the construction of the MARCH2 KO cell line, and strongly suggest that it is

a promising tool for studying the functions and related mechanisms of MARCH2.

Keywords

MARCH2, CRISPR/Cas9, Gene Knockout, Frameshift Mutation

应用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建沉默

MARCH2的细胞系

夏 丹

山东医学高等专科学校病理教研室，山东 临沂

夏丹

DOI: 10.12677/acm.2019.94058 384 临床医学进展

收稿日期：2019年3月6日；录用日期：2019年3月22日；发布日期：2019年3月29日

摘 要

CRISPR/Cas9系统是一种先进的基因编辑技术，人工设计先导RNA (single-guide RNA, sgRNA)介导外源

表达的Cas9蛋白特异性的结合、切割基因组靶点，切割后的DNA有非同源末端连接(non-homologous

end joining, NHEJ)和同源重组(homologous recombination)两种修复方式，以构建基因特异性敲除或

敲入细胞。The membrane associated RING-CH (MARCH)家族由一系列结构相关的蛋白组成，目前，

在人类基因组中至少有11个已知成员(MARCH-1–11)。MARCH2参与囊泡运输的调节，如突触囊泡的形

成、细胞内运动、胞外分泌和内吞。在本研究中，我们针对MARCH2基因第二外显子设计了CRISPR/Cas9

干扰靶序列，并应用蛋白质印迹方法对其基因剔除的有效性进行了验证，结果显示在两个MARCH2等位

基因都含有移码突变，证实我们应用CRISPR/Cas9系统成功构建了MARCH2敲除的细胞系，这将是

MARCH2功能及相关机制研究的强有力的工具。

关键词

MARCH2，CRISPR/Cas9，基因敲除，移码突变

Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是一段串联重复序列，先后在原核生物

大肠杆菌基因组中以及细菌和古细菌中发现CRISPR的存在，并且CRISPR具有抵御外来噬菌体入侵的

功能[1] [2]。CRISPR中重复序列和间隔可变序列分别21~48 bp、21~72 bp，CRISPR基因座转录加工为

成熟的crRNA。CAS基因定位在CRISPR基因座附近的区域，编码具有核酸酶和解旋酶活性的蛋白，与

crRNA形成的蛋白核酸复合物可以识别DNA序列上的PAM (protospacer adjacent motif)区域，特异性切

割DNA双链，发挥免疫防御功能[3] [4]。利用此特性可将其用作人工核酸内切酶，对基因组特定位点进

行遗传修饰，精确编辑基因组[5]。CRISPR/Cas9系统就是基于此原理人为优化的基因组编辑系统，人工

设计先导RNA (single-guide RNA, sgRNA)介导外源表达的Cas9蛋白特异性的结合、切割基因组靶点[6]，

切割后的DNA有非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重组(homologous recombina-

tion)两种修复方式。在无外源的同源DNA存在时，切割的DNA可通过NHEJ连接结合，这样在切割位

点就会引入插入或缺失序列，进而引发目的基因编码的蛋白产生移码突变以实现对目的基因的敲除。如

果有同源片段存在，切割的DNA则发生同源重组，将外源片段整合到基因组中，以实现基因的敲除、敲

入或突变等。

MARCH2 (membrane associated RING-CH protein 2)是MARCH家族成员之一，含有RING结构域，

具有E3泛素连接酶活性，调节多种细胞活动如细胞运输、DNA修复和信号转导[7]。MARCH2作为跨膜

泛素连接酶家族成员之一，近来被报道与病毒免疫逃逸蛋白有密切关系[8]。MARCH2最初的作用主要是

通过与syntaxin 6 (STX6)相互作用参与囊泡运输[9]。泛素化过程被广泛称为蛋白的“死亡之吻”，因为夏丹

DOI: 10.12677/acm.2019.94058 385 临床医学进展

如果将一个小分子泛素附在蛋白上，就会使此蛋白失去活性，这个小分子泛素就是一个标签，它向蛋白

运输载体发出信号使其运输蛋白到蛋白酶体以降解之。作为E3泛素连接酶家族成员之一，MARCH2可

以泛素化几种底物，如DLG1 [10]，β2AR [11]，和CFTR [12]。

我们选用目前最先进CRISPR/Cas9基因编辑技术来构建稳定敲除MARCH2的细胞系作为MARCH2

功能研究更有效的工具。

2. 材料和方法

2.1. 材料和试剂

兔抗人MARCH2多克隆抗体购自美国Abcam公司；ACTB/b-actin抗体购自Tianjin Sungene公司；

Megatran 1.0转染试剂购自Biotum公司；细胞和组织基因组DNA提取试剂盒购自华中海威公司；

PX330-MARCH2-sgRNA质粒购自上海南方模式生物科技发展有限公司；MARCH2 DNA引物购自

Invitrogen公司。

2.2. 合成sgRNA寡核苷酸序列并构建载体

由上海南方模式生物科技发展有限公司设计CRISPR干扰靶序列，并针对人类的MARCH2基因构建

CRISPR-Cas9表达载体。

Guide RNA靶序列如下：

Guide RNA target site 1：GCCCGTAGCCTCCACGACCT TGG

Guide RNA target site 2：TCCAAGGTCGTGGAGGCTAC GGG

载体构建：载体PX330-GFP使用Bbs I酶切电回收，分别与MARCH2-V-Gui-F/R，

MARCH2-V-Gui-F2/R2退火产物连接转化，涂布于氨苄平板上，37℃培养过夜。次日，分别挑取3个单

克隆，使用引物u6-gui-id-f测序。

质粒纯化：测序正确的克隆接种4 ml LB，使用QIAGEN Plasmid Midi Kit抽提质粒，溶于Nuclease-Free

Water中，−30℃保存待用。

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基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤

基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤

基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤

基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种革命性的工具，能够精确切割和修改DNA序列。它已被广泛应用于实验室研究、农业、医学和生物技术领域。CRISPR-Cas9的操作步骤分为设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选、验证等几个阶段。以下是基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤：

1. 设计目标序列

首先，确定要编辑的基因序列。识别目标区域，通常选择高度保守的DNA区域，以最大程度减少非特异性修饰。目标序列的设计需要遵循一些规则，例如避免重复、剪切酶的PAM序列靠近目标区域等。

2. 构建修饰体

根据设计的目标序列，构建CRISPR修饰体。修饰体通常由CRISPR核酸（包括crRNA或sgRNA）和Cas9核酸组成。crRNA（或sgRNA）负责定位到目标序列，Cas9则负责剪切目标序列。合成修饰体的DNA或RNA序列后，可以使用PCR扩增或化学合成的方法得到修饰体。

3. 细胞转染

将构建好的修饰体转染至目标细胞中。转染可以选择不同的方法，例如化学法、电穿孔法、超声波法或病毒载体等。转染后，修饰体会逐渐进入目标细胞，并开始作用于基因组。

4. 筛选

在转染后，大部分细胞仍然具有未被编辑的基因组。为了筛选出完成编辑的细胞，可以使用筛选方法。最常用的方法是通过引入荧光蛋白标记的修饰体，利用流式细胞术或显微镜检查标记的细胞。 5. 验证

对于筛选出来的细胞，需要进行进一步的验证。最常用的方法是通过测序确认基因组是否发生了预期的编辑。此外，也可以使用T7E1酶切或限制性内切酶消化等方法，进一步验证编辑效果的准确性。

总结起来，基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤包括设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选和验证等几个阶段。通过遵循这些步骤，研究人员可以实现对目标基因组的精确编辑，进而揭示基因功能、治疗遗传疾病，并在农业和生物技术领域开拓新的应用前景。

应用CRISPRCas9系统构建大肠埃希氏菌irp2基因缺失株

应用CRISPRCas9系统构建大肠埃希氏菌irp2基因缺失株

动物医学进展,2021 ,2(1):50-55

Progress in Veterinary Medicine

应用CRISPR/Cas9

系统构建大肠埃希氏菌irp2

基因缺失株

富国文，单春兰，敖平星，赵汝，高丽波，刘超英，高洪

*

（云南农业大学动物医学院，云南昆明650201

）

摘要：

CRISPR/Cas9

是一个新兴的基因编辑技术，利用该技术对临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希

氏菌中的irp2

基因进行编辑，为进一步研究该基因在致病中的作用提供基础。首先构建靶向irp2

基因的

sgRNA,PCR

扩增上、下游同源臂，利用重叠PCR

技术连接sgRNA

与上、下游同源臂，再通过酶切与酶连构

建出靶向irp2

基因的pTargetF

重组质粒。将pCas

与pTargetF

重组质粒转化临床分离的撒坝猪致病性大

肠埃希氏菌中，成功构建了该菌株的irp2

基因缺失菌株，为进一步研究其致病机制奠定基础。

关键词：CRISPR/Cas9；

大肠埃希氏菌；irp2

基因缺失菌株

中图分类号:S85. 2. 612；Q789

文献标识码:A

文章编号：1007-5038（2021）01-0050-06

耶尔森氏菌强毒力岛（Yersinia high-pathogeni- 簇［1］。研究表明，耶尔森氏菌HPI不仅可以通过耶

ticity island, HPI）主要含有与摄铁有关的毒力基因 尔森氏菌素（Yersiniabactin , Ybt）的铁载体夺取宿

收稿日期：2020-0327

基金项目：

国家自然科学基金项目（31660704,31960692

）

作者简介：

富国文（1980 —

），男

（满族），辽宁西丰人，博士研究生，主要从事特种经济动物饲养研究。*通讯作者

and antimicrobial susceptibllty of

Mannheimia haemolytica ,

PasLeurelta mulbocida , and

IUsLophilus somni isolated from

用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建

用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建

中国预防兽医学报ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine第42卷第12期2020年12月Vol.42No.12Dec.2020doi：10.3969/j.issn.1008-0589.202002012用于CRISPR文库筛选的N2a-Cas9细胞系的构建张纪文，王露露，李芳，刘杏，赵东明*，步志高*（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069）摘要：为了进行CRISPR文库筛选，本研究采用慢病毒转导的方法利用N2a细胞构建表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系。实验将LentiCas9-Blast、pSPAX2和pMD2.G3种质粒共转染人胚胎肾细胞（HEK293T）获取高滴度的重组慢病毒，收集重组慢病毒并感染N2a细胞，经杀稻瘟菌素（Blasticidin）筛选，通过有限稀释法获得含有Cas9基因的多个单克隆细胞株。Westernblot结果显示候选细胞系高水平表达Cas9蛋白；利用慢病毒表达报告基因载体系统检测显示候选细胞系的Cas9蛋白具有很高的切割活力；利用CellTiter-Glo试剂检测结果显示，Cas9基因在候选细胞系内高表达但不影响细胞增殖活性。本研究利用慢病毒转导系统构建了稳定表达Cas9蛋白的N2a-Cas9单克隆细胞系，为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量筛选技术探究神经细胞内关键宿主基因调控狂犬病病毒嗜神经性提供研究基础。关键词：基因编辑；慢病毒；高通量筛选；鼠神经瘤母细胞中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589（2020）12-1292-04ConstructionofN2a-Cas9celllineforgenome-wideCRISPRscreeningZHANGJi-wen,WANGLu-lu,LIFang,LIUXing,ZHAODong-ming*,BUZhi-gao*(StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150069,China)Abstract:Inthisstudy,mouseneuroblastoma(N2a)cellswereusedtoconstructN2a-Cas9celllinewhichstablyexpressesCas9proteinbyusinglentivirustransfectiontechnology.ThisconstrctedcellslinelaidthefoundationforCRISPRlibraryscreening.First,threeplasmidsincludingLentiCas9-Blast,pSPAX2,andpMD2.Gwereco-transfectedintohumanrenalepithelialcells(HEK293T)toobtainrecombinantlentiviruswithhightiters.N2acellswereinfectedwiththerecombinantlentivirus,andthenscreenedbyBlasticidin.Finally,severalmonoclonalcelllinesexpressingCas9proteinwereisolatedbylimitingdilution.TheexpressionofCas9expressioninN2a-Cas9celllinewasdeterminedbywesternblot,andthehighcleavageactivityofCas9wasalsoexaminedbyusinglentivirus-basedreportervectorsystem.ByusingCellTiter-Glo®reagent,thecellproliferationactivitywaswelldetectableandnotdecreasedinN2a-Cas9celllines,whereCas9genewasexpressedinahighlevel.Therefore,N2a-Cas9celllinewassuccessfullyconstructedusingalentiviraltransfectionsystem,whichcanprovideabasisforgenome-wideCRISPRscreeningtoidentifycrucialhostfactorsregulatingRabiesvirusneuro-tropism.Keywords:geneediting;lentivirus;genome-wideCRISPRscreening;murineneuroblastoma

基于CRISPR-Cas9技术建立ATRX基因敲除的HeLa细胞系共3篇

基于CRISPR-Cas9技术建立ATRX基因敲除的HeLa细胞系共3篇

基于CRISPR-Cas9技术建立ATRX基因敲除的HeLa细胞系共3篇

基于CRISPR/Cas9技术建立ATRX基因敲除的HeLa细胞系1

基于CRISPR/Cas9技术建立ATRX基因敲除的HeLa细胞系

导言

ATRX基因是染色质重塑复合物的核心成分之一，其作用涉及到基因的表达、染色质稳定性和细胞增殖等多种生物学过程。因此，研究ATRX基因的作用机制具有重要的意义。本文利用CRISPR/Cas9技术，建立了HeLa细胞中ATRX基因的敲除模型，为深入探究ATRX基因的作用机制提供了实验基础。

材料和方法

1. 细胞系和培养条件

本实验采用HeLa细胞系作为研究模型，细胞培养条件为37°C、5%CO2，DMEM高糖培养基（Gibco）中添加10%胎牛血清（Gibco）和1%青霉素/链霉素（Solarbio）。

2. CRISPR/Cas9质粒的构建和转染

我们设计了两个靶序列，克隆到pLenti-CRISPR-v2质粒中，构建了ATRX基因的敲除质粒。转染条件为细胞密度达到80%时，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）进行转染，转染48小时后进行筛选。

3. PCR和Western blot

我们从转染后48小时的细胞中提取基因组DNA，利用PCR技术检测ATRX基因的敲除情况。Western blot技术检测ATRX蛋白的表达情况。

结果

1. ATRX基因的敲除

我们设计的两个靶序列对ATRX基因进行了敲除，并验证了基因组DNA的PCR产物。结果显示，我们得到了ATRX基因敲除成功的细胞系。

2. ATRX蛋白的表达

Western blot结果显示，ATRX蛋白在敲除组中出现了明显的降低，与对照组相比，差异显著。

讨论

本实验成功建立了ATRX基因敲除的HeLa细胞系，为探究ATRX基因在细胞内的作用机制提供了实验基础。ATRX基因作为染色质重塑复合物的核心成分之一，在基因的表达、染色质稳定性和细胞增殖等方面扮演着重要的角色。因此，我们将进一步研究ATRX敲除对这些生物学过程的影响，探究其作用机制。