小鼠肝脏组织中ABCA1基因的检测与分析
- 格式：doc
- 大小：326.50 KB
- 文档页数：16
目 录
1前言…………………………………………………………………………………1
1.1 ABCA1基因的作用及特点………………………………………………………1
1.2 ABCA1基因研究的目的和意义…………………………………………………1
1.3基因检测及定量的基本原理……………………………………………………2
1.4 PCR扩增目的基因………………………………………………………………2
1.4.1 RNA的提取要求………………………………………………………………2
1.4.2cDNA的合成……………………………………………………………………2
1.4.2.1cDNA第一链的合成条件……………………………………………………2
1.4.2.2cDNA第二链的合成…………………………………………………………2
1.4.3 PCR荧光定量特点及原理……………………………………………………3
1.4.3.1 PCR技术的特点……………………………………………………………3
1.4.3.2实时荧光定量PCR技术原理………………………………………………3
1.5实时荧光定量基因检测方法的应用……………………………………………4
1.6 ABCA1基因研究的现状及发展趋势……………………………………………4
1.7本文研究的意义…………………………………………………………………5
2材料与方法…………………………………………………………………………5
2.1试验的时间、地点………………………………………………………………5
2.1.1实验时间………………………………………………………………………5
2.1.2实验地点………………………………………………………………………5
2.2实验材料与器材…………………………………………………………………5
2.2.1样品的选取……………………………………………………………………5
2.2.2主要仪器………………………………………………………………………5
2.2.3主要试剂………………………………………………………………………5
2.3主要试验方法……………………………………………………………………6
2.3.1 RNA的提取过程………………………………………………………………6
2.3.2 cDNA的合成过程……………………………………………………………6
2.3.3荧光定量过程…………………………………………………………………6 3结果与分析…………………………………………………………………………7
3.1 RNA的提取的纯度分析…………………………………………………………7
3.2荧光定量的分析…………………………………………………………………7
3.3基因相对定量的结果……………………………………………………………9
3.3.1相对定量的实验结果…………………………………………………………9
3.3.2相对定量的结果分析…………………………………………………………9
4讨论 ………………………………………………………………………………10
4.1RNA提取操作中的常见问题……………………………………………………10
4.2 cDNA合成操作中的注意事项…………………………………………………10
4.3PCR荧光定量的注意事项………………………………………………………10
5结论 ………………………………………………………………………………10
参考文献 ……………………………………………………………………………11
致谢 …………………………………………………………………………………12
附录1相关英文文献 ………………………………………………………………13
附录2相关英文文献翻译 …………………………………………………………23
摘 要
本文运用RT-PCR方法从患有颈动脉粥样硬化的小鼠肝脏组织中提取总的RNA，然后合成cDNA序列，最后应用Real-time PCR法检测了服用不同时长的通心络药品的实验小鼠肝脏组织中ABCA1基因的表达情况。通过研究表明，服用通心络可以增强小鼠肝脏组织中ABCA1基因的表达水平，并且药品的服用时长与ABCA1基因的表达水平的高低成正相关，进而得知通心络治疗颈动脉粥样硬化的作用机理。小鼠肝脏组织中ABCA1基因的研究，可以为进一步探讨ABCA1基因变异有关的疾病的课题提供理论依据和基础。
关键词：ABCA1；Real-time PCR；小鼠；检测；肝脏组织
ABSTRACT
In this paper, the total RNA is extracted from liver tissue in mice with carotid
atherosclerosis by RT-PCR method. Next combining the sequence of cDNA, the
application of Real-time PCR was used to detect experimental mice liver tissue
expression of ABCA1 gene, the mice had been taken tongxinluo drugs in different
time. Studies have shown that taking Tongxinluo can enhance the expression levels
of ABCA1 gene in mouse liver tissue, and the length of the drug taking time is
positively correlated with the length of ABCA1 gene expression level, then learned
that tongxinluo’s mechanism for the treatment of carotid artery atherosclerosis.
Investigation of ABCA1 gene in mice liver tissue can provide theoretical basis and
foundation for exploring the further subject of the diseases about ABCA1 gene
mutation.
Key word: ABCA1; Real-time PCR; mice; determination; liver tissue
小鼠肝脏组织中ABCA1基因的检测与分析
刘芳
（天津农学院 动物科学系）
1. 前言
1.1 ABCA1基因的作用及特点
ABCA1是到目前为止研究最多、最重要的促进胆固醇流出的细胞表面蛋白。
ABCA1是ATP结合盒转运子(ABC)超家族的成员。人们证明了ABCA1基因的缺陷是Tangier病的病因,后来又发现ABCA1基因变异与家族性HDL缺乏(FHD)有密切的相关性[1]。现在已经证实ABCA1的主要功能是作用于胆固醇的逆转运(RCT)。随着对ABCA1基因的研究的不断深入,人们发现不仅在具有家族遗传病的人群中ABCA1的突变发挥作用,在普通人群中ABCA1单核苷酸多样性(SNP)也可导致ABCA1基因功能发生改变。
胆固醇的逆转运是外周组织通过血浆脂蛋白转将过多的胆固醇转运到肝脏并通过肝脏作用后排泄的过程。人们对细胞内胆固醇的流出的过程和载脂蛋白在胆固醇流出过程中的作用早有认识,但对于ABCA1在胆固醇流出中作用的重要性是在后来才发现的。由于人类ABCA1基因特殊的结构组成，以及其编码的ABCA1膜蛋白的特殊性，使得ABCA1不直接作用于胆固醇,而是转运磷脂。磷脂被转运出去后,与细胞外的apoAⅠ形成复合物,胆固醇才能扩散出去,然后盘状的磷脂apoAⅠ复合物将其捕获,形成前β-HDL。在卵磷脂胆固醇酯酰转移酶(LCAT)的作用下,转变成含有胆固醇酯(CE)成熟的球状HDL。由于ABCA1可以促进细胞内胆固醇和磷脂转移至HDL前体apoAⅠ ,因此ABCA1蛋白在RCT中起限速作用。ABCA1活性也是血浆HDL细胞水平的一个重要的决定因素。
1.2 ABCA1基因研究的目的和意义
ABCA1基因的启动子区SNP对ABCA1的表达起着重要的控制作用。到目前为止,已经发现了90多个与疾病有关的ABCA1基因的变异或SNP位点,但是这些SNP在人群中的发生概率差异特别大，需要我们根据对ABCA1基因的结构特点以及与疾病之间的关系，建立致病机理进行差异性的研究，来解决这些疾病问题。
随着人们对ABCA1基因认识的不断深入,对于ABCA1所介导的RCT及基因多样性的研究将有助于研究人类的重大疾病——冠心病的发病机制,预测出疾病的临床表型,并指导差异化的临床治疗方案[2]。由于目前来调节ABCA1表达的药物特别少，只有辛伐他丁，通心络少数药物,因此深入探讨ABCA1的功能及ABCA1表达的调控机制,对于未来开发和找寻对ABCA1表达有特异性作用的调控药物,起到预防、治疗高脂血症，AS，CAD等疾病，在人类健康方面具有特别重要的意义。
1.3 基因检测及定量的基本原理
从真核生物的组织或细胞中提取mRNA或总RNA,通过用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,PCR转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建所得的cDNA文库可用于基因的结构、表达和调控的分析或比较cDNA和相应基因组DNA序列差异。即是利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量相对定量方法比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异，从而确定基因的扩增的效果。
1.4 PCR扩增目的基因
1.4.1 RNA的提取要求
基因分离是研究基因结构、功能、表达与调控的必需条件，同时也是进行基因治疗的重要条件。首先是总RNA的提取，要获取正确的总RNA，提取总RNA所使用的基本材料必须选择合适。因为在总RNA中的mRNA具有其明显的组织，细胞特异性。因此，某组织，细胞材料选取不当，则不可能获得预期结果[3]。组织细胞的选择除了种类的选择之外还有细胞状态的选择。我们可以采用目的基因表达的刺激剂来促进细胞表达目的RNA，使其含量增加到期望值。此外，在各种操作中应严格防止RNA酶污染。
1.4.2 cDNA的合成
1.4.2.1cDNA第一链的合成条件
合成cDNA第一链的方法依赖于反转录酶来催化反应。目前商品化反转录酶有禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包含两个具有很多种酶活性的多肽亚基,这活性中包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的DNA合成，对DNA:RNA的杂交体的RNA进行内切降解(即RNA酶H活性)。而MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备有依赖于RNA与依赖于DNA的DNA合成酶活性,但是降解RNA:DNA的杂交体中的RNA的能力比较弱,且较AMV对热的稳定性的反转录酶作用差。MLV反转录酶能够合成较长的cDNA。AMV， MLV反转录酶在利用RNA为模板合成cDNA时，其最适pH值、最适盐浓度、最适温室各不相同,因此在合成第一链时调整相应条件是非常重要。 但是AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有
