细胞工程思考题

细胞工程（动物部分）思考题生技1402 李静1402140105一、动物原代细胞培养应注意哪些问题?答：动物原代细胞培养分为取材、分离细胞、制备成可用于培养的组织块或细胞、接种到合适的无菌培养液中、在适宜的环境条件下进行体外培养等,每个阶段需要注意的问题如下：1)在取材阶段我们需要注意取材部位是否准确、所取材料是否保持活性、材料处理是否得当等问题，一般选择在动物幼小时取材。

整个取材过程一般要在超净工作台或其他工作台面上进行。

在无菌条件下取出组织和器官，放在BSS或培养液中，立即送往实验室。

如果不可避免的要延误时间，如去屠宰场或临床手术室取材时，解取的组织应立即冷却，然后尽快送往实验室;；2)在分离细胞时，由于组织均由多种细胞和纤维成分组成，一般体积大于1mm3 的组织块置于培养瓶后，处于周边的少量细胞可能生存和生长，而大部分细胞因营养物质穿透有限而代谢不良，且受纤维成分束缚而难以移出。

为获取较大量生长良好的细胞，必须把组织分散开，使细胞充分解离出来，但不伤害细胞本身；一定要注意多余水分的去除，水分若不除去，会使组织块剪切不细，消化后的细胞悬液清亮（细胞数少），并可见消化液中有线状或絮状物漂浮。

原代培养的贴壁细胞需控制消化时间。

吹打已消化的细胞应减少机械损伤。

3)在培养细胞时，为促进组织块尽快粘贴在培养瓶上，可以在接种前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。

细胞培养过程中，胶原中的促细胞贴附因子先吸附于培养瓶底壁上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促细胞贴附因子的底壁附着；4)用组织块培养时，要及时观察。

当发现细胞向外迁移出来后，要记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除；5)加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。

6)组织块接种后的前3d，从组织块向外迁移的细胞数很少，组织块的粘附不牢固。

在观察和移动过程中，注意不要引起液体的振荡。

要避免经常翻动或振动，否则组织块不易附着在瓶壁上或附着后也会脱落漂起。

7)所有过程中也要注意消毒工作：用工作台消毒镊子取浸泡在酒精中消毒的器械。

器械置无菌干纱布内嚓一下。

迅速通过火焰，冷却后使用。

用过的器械置另一加盖的器皿中再消毒。

器械按浸泡消毒的顺序使用。

各套再消毒器械不可混用。

8)另外还需注意：细胞生长密度不高时，不能急于传代培养。

首次传代细胞接种数量应多一点。

首次传代细胞培养PH偏低些。

小牛血清浓度可加大至15%—20%。

二、查阅文献了解动物细胞大规模培养的应用及存在的问题参考文献：[1]林福玉, 陈昭烈, 刘红, 黄培堂.大规模动物细胞培养的问题及对策[J].生物技术通报,1999,(1):32-35.[2]梅建国,庄金秋,王金良,王玉茂,丁壮,沈志强. 动物细胞大规模培养技术[J]. 中国生物工程杂志,2012,(07):127-132.[3] 毕军,王强,孙文.Vero细胞微载体放大培养技术研究[J].中国医药生物技术,2016,(03):275-277.[4]徐家华,陈瑞爱,唐秀英,林绮萍,黄文科,黄星强.动物细胞规模化培养及其在兽用疫苗生产中的应用[J].动物医学进展,2009,(05):105-108.[5]张瑞,韩宝三,吴薇,吴旭波,彭承宏.微载体及其在肝细胞培养中的作用与应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,(32):6331-6334.应用：1.利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等,已成为医药生物高技术产业的重要部分。

2.目前，国内大部分疫苗企业仍采用传统的转瓶细胞培养工艺来生产病毒性疫苗，该方法存在细胞密度低、病毒滴度低、劳动强度大等缺点。

20 世纪 70 年代，建立了微载体/生物反应器培养动物细胞的工艺，把悬浮培养和贴壁培养两种培养工艺融合在一起，兼有两者的优点，使得动物细胞工业化的大规模、高密度培养，以满足生物技术发展的需要，而细胞微载体放大培养就是其中的关键技术之一。

通过胰酶消化微载体上 Vero 细胞，实现了 5 L到 50 L 生物反应器的放大培养，为后续更大规模的生物反应器培养Vero 细胞，生产病毒性疫苗奠定基础并积累经验。

3.哺乳动物细胞大规模培养技术已经广泛应用于生产各种生物制品, 也广泛应用于各种兽用疫苗的生产。

细胞培养生产兽用疫苗不但能够降低成本, 而且提高产品质量。

细胞培养生产兽用疫苗已经成为各个生物制品公司关注的焦点。

4.从当前发展趋势来看, 细胞悬浮培养(suspended-cell cul tue ,SCC)、无血清培养(serum f ree culture , SFC), 是近年世界范围内各大生物公司产业化生产的发展方向。

SCC 、SFC 在规模化生产提高单位产量、细胞培养密度、降低生产成本、保证大规模生产的产品质量等方面都起到重要作用, 是产业化的最有效途径, 是目前世界各大生物制品公司竞相开发的前沿课题。

5.微载体具有比表面较大等优点，是目前较常用而有效的动物细胞大规模培养的载体，微载体培养技术已经成为动物细胞工程的基础和细胞学研究的主要技术和热点之一，广泛地应用于生产一些具有重要实用和商业价值的产品，积累了大量的实践经验和关键的实验数据，并在肝细胞、软骨细胞、成纤维细胞等组织工程种子大规模扩增研究领域取得了许多进展。

存在的问题：1.由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性、产品质量以及一致性的要求,动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模化生产的需求,进一步研究与发展细胞培养工艺成为迫切需要。

2.细胞密度和产物浓度低，细胞群体在大规模长时间的培养过程中分泌产物的能力易丢失活产物活性降低，培养成本高，产品价格昂贵，对细胞代谢和生长特性的基础研究比较欠缺，在线检测技术尚不完善，限制了优良培养系统的开发等。

3.随着细胞培养规模和培养密度的增大,二氧化碳的产生速率比通过换气从培养基中去除二氧化碳快而导致CO2 积聚,从而对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。

4.如何开发剪切力低、混合效率高的液体设备系统在动物细胞高密度培养中显得尤为重要，也是制造大规模反应器系统的难题之一。

如何开发快捷高效的细胞截留系统、取样与分析系统等也成为大规模细胞培养技术的难点问题。

5.尽管无血清悬浮培养技术有着广阔的应用前景，但培养基的研制成本高、细胞适用谱窄以及工程细胞株的构建和驯化技术还不很成熟等关键性技术问题仍未能很好解决，大大影响了这一技术的推广应用。

6.微载体培养技术一定程度上解决了贴壁依赖性细胞的大规模培养问题，但由于微载体制备成本高，而且相关技术一直为少数大型跨国公司所垄断，使得微载体产品价格相当昂贵，为该技术的推广应用设置了较高的成本障碍。

而且，微载体与细胞的大规模分离过程繁琐、细胞在载体之间的自主转移困难等问题也增加了微载体悬浮培养技术规模化放大的难度。

7.动物细胞与微生物和植物细胞不同, 因其无细胞壁, 并且整个细胞非常脆, 机体外培养的生长缓慢, 容易死亡。

动物细胞培养尤其是高密度(1 ×107个/mL)培养时细胞培养条件要求非常高, 而高密度细胞培养是生物制品和疫苗工业化生产降低产品成本和提高产品质量的关键技术之一。

大规模细胞培养过程中存在许多影响细胞生长和增殖的因素, 如pH 、温度、营养成分、溶液中溶解氧量、细胞代谢产物、生长因子、细胞外基质、剪切应力(shearstress , SS)和细胞凋亡(cel l apoptosis , CA)。

细胞随着培养基中营养物质的消耗和代谢产物的聚集,生长速度会逐渐减慢。

工业化生产过程中精确调节细胞各种培养参数维持细胞快速生长, 增加细胞最终密度, 防止CA 是增加产品产量和保证产品质量的关键因素之一。

氧难溶于培养基, 但又是动物细胞生长所必需的, 因此, 生物反应器中氧的传递速率通常是细大规模培养的关键限制因素。

近来越来越多的研究表明, 细胞所产生的CO2 超过一定浓度时会抑制细胞生长。

生物反应器可以通过通风和灌注等方法使氧的传递和CO2 的清除达到一定的平衡, 能够降低生物反应器中CO2 含量。

细胞培养环境直接与细胞生长状况和产品质量密切相关, 因此, 有必要精确控制影响细胞生长的各种因素。

生物反应器通常有自动监测系统, 一般情况下生物反应器中细胞生长环境是相对稳定的。

但在某些条件下, 例如细胞高密度培养时, 由于培养基中毒代谢产物聚集越来越多, 直接影响着细胞的生长和产品的质量，这时怎么调节影响细胞生长的各种因素就非常重要了。

三、比较动物细胞的超低温保存与植物材料的超低温保存在技术上的异同相同点：1.一般都是使用液氮为冷源，将生物材料保存在-196O C，在这种超低温条件下，活细胞内的新陈代谢和生长活动几乎完全停止，因而可使生物材料不会发生遗传性状的改变，细胞活力和形态发生的潜能可以保存，这就有可能极大的延长储存材料的寿命，从而有效、安全地长期保存那些珍贵稀有的生物品种；2.都需要冰冻保护剂，而且都要进行冰冷冻保护剂的预冷，而且使用冰冻保护剂的浓度、渗入细胞的能力和对水分活性影响等各不相同，使用浓度也因此各有不同，在植物和动物的冰冻保护剂都是最常使用DMSO，都可以配合其他试剂一起使用效果更佳；3.将装有细胞的离心管放入冰浴中后，都需要沿离心管壁缓缓滴加预冷的保护液，是为了防止对细胞的渗透冲击；4.无论是动物细胞还是植物细胞，在降温中避免细胞内结冰是超低温保存能否成功的关键因素；5.都可以应用玻璃化法冻存，具有较高的存活率；6.化冻操作时都需要避免在化冻过程中产生细胞的次生结冰，并防止化冻吸水过程中水的渗透冲击造成细胞膜的损坏。

不同点：1.相对动物细胞而言，植物材料都需要进行预培养和预处理，目的是减少细胞自由水的含量，使细胞经受低温锻炼，以有效提高组织或细胞的抗冻能力，需要加入一些可以降低水势和提高材料抗冻能力的物质，最常用的方法是增加培养基中蔗糖的浓度，将选好的材料在低温下锻炼数天，就有可能大大提高液氮保存的存活率。

2.植物细胞冻存时加入的复合冰冻保护剂一般是DMSO、PEG-6000、蔗糖和氯化钙等，在动物细胞超低温保存时也必须使用冷冻保存剂，目前联合使用两种以上冷冻保护剂的趋势，在冷冻保护液中加入血清有利于冻存细胞活性的保持，许多实验室将冷冻保护液中的血清浓度提高至30%、50%，甚至完全用血清+DMSO冻存。

3.植物细胞冻存和复苏的方式众多，如快冻法，慢冻法，两步/逐级冷冻法、包埋脱水法。

玻璃化法等等，动物细胞冻存和复苏的基本原则都是慢冻快融。

慢冻快融在细胞外形成，因此不致损害细胞。

不同细胞的最适冻存速率、过程、冷冻保护剂种类和用量等不同。