湖南农业科学２０１１，（３）：１１９～１２１，１２６ Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
大肠杆菌工程菌Ｋ１ ２ＡｄａｐＡ发酵产
Ｌ一苏氨酸培养基的优化
杨晓志，李伟星，张君胜，张力
（江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏泰州２２５３００）
摘 要：对大肠杆菌工程菌株Ｋ１２ＡｄａｐＡ的摇瓶分批发酵条件进行了研究。采用正交设计、均匀设计等试验方法，应用ＳＰＳＳ数 据处理系统和均匀设计试验方法和分析系统（ＭＤＡＳ）获得了该菌株种子培养基与发酵培养基优化配比，并对种子培养条件与发 酵条件进行了研究。在优化条件下，大肠杆菌工程菌Ｋ１２ＡｄａｐＡ摇瓶分批发酵７２ ｈ，产Ｌ一苏氨酸达８．２ ｇ／Ｌ，提高了１．２倍。 关键词：Ｌ一苏氨酸；大肠杆菌；发酵条件 中图分类号：Ｑ９３９．９７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—０６０Ｘ（２０１１）０３—０Ｉ１９—０３
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎ Ｋ１２ Ａ ｄａｐＡ
ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｌ—－ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ
ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｚｈｉ，ＬＩ Ｗｅｉ－ｘｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｊｕｎ－ｓｈｅｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ
（Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｔａｉｚｈｏｕ ２２５３００，ＰＲＣ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ Ｋ１２ ＡｄａｐＡ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｗｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ ｗｅｒｅ
ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ Ｋ１２ ＡｄａｐＡ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｕｎｉｆｏｒｍ ｄｅｓｉｇｎ ｍｅｔｈｏｄ，ＳＰＳＳ ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｎｄ ＭＤＡＳ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ ｌ ２ Ａ ｄａｐＡ ｉｎ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ ｆｏｒ ７２ ｈ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ Ｌ—ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｗｉｔｈ ８．２ ｇ／Ｌ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ １．２ ｔｉｍｅｓ
重组大肠杆菌DE-pET-P46的培养基优化和高密度发酵
沈青春;宁宜宝;王芳;张纯萍;高和义;宋立;李聪研;魏晶晶;宋萧婷;苏鹏
【摘 要】为提高重组蛋白的生产效率，利用响应面试验设计技术，对表达猪肺炎支原体P 46蛋白的重组大肠杆菌DE-pET-P46的培养基进行了优化，确定了培养基各营养成分及其最佳配比。在相同培养条件下，优化培养基比LB培养基的菌体浓度高出一倍。在生物反应器中利用优化培养基发酵培养该重组大肠杆菌，培养物的湿菌重达39．5 g/L。 SDS-PAGE电泳结果显示，高密度发酵对重组大肠杆菌DE-pET-P46的rP46的表达和占细胞总蛋白比例均没有明显的改变。%For
higher efficiency and lower cost of the protein production, response
surface analysis(RSA) was used for culture optimization of the recombinant
E. coli which could express Mycoplasma hyopneumoniae P46 protein, and
the best ratio of each medium component was determined. Under the
same culture conditions, the cell concentration of the optimized culture is
twice higher than LB medium. The medium used in a bioreactor for the
recombinant E. coli DE-pET-P46 culture fermentation, the wet bacteria
weight of the culture is up to 39.5 g/L. SDS-PAGE electrophoresis showed
大肠杆菌发酵经验总结
首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸
乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
大肠杆菌发酵经验总结
首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速
率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温
度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较
高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两
个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近
稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于
代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比
例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现
溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适
当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先
总结以下几点，并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸
乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后
蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，
