植物细胞骨架的光学和荧光显微镜观察

第九章 细胞骨架

学习纲要：

1. 细胞骨架涵义。

2. 微丝：成分，装配，结合蛋白，功能。

3. 微管：成分，装配，发生，功能。

4. 了解：中间纤维。

5. 核基质：概念，成分，功能。

6. 了解：染色体支架，核纤层。

7.思考：（1）通过本章学习，对细胞生命活动的组织有何新的认识？（2）各类骨架在细胞中的动态变化与细胞周期活动的关系。

练习题：

一名词解释：细胞骨架、核骨架、核纤层、 MTOC、MAR、踏车现象

二填空题：

１细胞骨架的分布各不相同，___________主要分布在核周围，放射状向四周扩散；________主要分布在细胞质膜内侧；而___________则分布在整个细胞。

２真核细胞的鞭毛由_____________构成，其组装过程中，以_____________作为MTOC，鞭毛的运动机制为_____________。

3动物细胞的MTOC是_____________，它决定了微管的极性，________________极指向MTOC。

4在神经轴突的物质转运过程中，由两种蛋白介导，一是________________，介导运输小泡由轴突顶端运向胞体；二是________________，介导小泡由胞体运向轴突顶端。

5几乎所有的人体细胞都有中间纤维蛋白表达，但其表达具有严格的________________；中间纤维蛋白基因表达的组织和发育调节主要在________________水平。

三判断题：

1 中心体是动物细胞中所有微管组装的起点。（ ）

2有丝分裂时，纺锤体微管的（-）端同染色体接触。（ ）

3微管装配时需要利用GTP水解释放的能量。（ ）

4秋水仙素结合到未聚合的微管二聚体上，阻止微管的成核反应。（ ）

5细胞中微丝的数量比微管多（ ）。

6无论是单体肌动蛋白还是肌动蛋白纤维，如果没有与ADP或ATP结合，则很快变性。（ ）

湖北师范学院生命科学学院 细胞生物学实验指导

- 0 - 实验一：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察

【基本原理】

细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。

细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。

本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。

由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。

【实验报告】

1．简图表示凝集素使血细胞凝集原理

2．怎样根据细胞膜渗透性实验结果分析确定物质进入细胞的速度？物质进入细胞的快慢有什么规律？

实验二：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合

【基本原理】

两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。

4.9.了解广义和狭义的细胞骨架概念：细胞骨架是指细胞中由纤维蛋白构成的空间网络结构。

广义的细胞骨架包括：细胞核骨架、细胞质骨架、质膜骨架以及胞外基质。

狭义的细胞骨架包括：细胞质骨架（微管、微丝、中间丝）

一、概念：细胞骨架是指用电子显微镜观察经非离子去污剂处理后的细胞，可以在细胞质内观察到一个复杂的纤维状网络结构体系，细胞骨架主要包括微丝、微管和中间丝。

二、细胞骨架的特点

1.细胞骨架由相应的蛋白亚基构成，在组装与解聚间二者达到平衡。

2.细胞骨架具有动态不稳定性，即一定条件下存在组装与去组装现象，在细胞生命活动中 起到重要作用。

（1）细胞周期中，细胞骨架经历动态的组装与去组装，周期性的重塑，在分裂期与分裂间

期，其分布与组织形式不同。

（2）踏车行为能够改变微管或微丝在细胞中的分布，可能与细胞运动有关。

（3）细胞分裂伴随着纺锤体的形成与解聚。

（4）细胞胞质环流伴随着细胞骨架的形成于解聚。

3.细胞骨架是三维的空间网状结构。

三、细胞骨架的功能特点

1.细胞骨架构成多种细胞结构。

（1）微管：鞭毛、纤毛、中心体、纺锤体

（2）微丝：微绒毛、收缩环、应力纤维、黏合斑、黏合带

（3）中间丝：桥粒、半桥粒

2.细胞骨架为细胞提供结构支撑，维持细胞形态。

3.细胞骨架介导细胞内物质运输、细胞器运输。

4.细胞骨架介导细胞运动。

5.细胞骨架对细胞分裂起到重要作用。

6.细胞骨架是细胞内结构与功能的空间组织者。

细胞内生物大分子或细胞器的分布具有不对称性，这与细胞骨架的不同组织方式有关， 其结构与功能相适应。

四、细胞骨架的研究方法

1.荧光显微镜

细胞骨架的蛋白亚基可与相应的荧光染料或荧光抗体特异性结合，从而通过荧光显微 镜观察其在活细胞中的组织、分布、功能与行为模式。

2.电子显微镜

细胞经非离子型去污剂处理后，可溶性物质与膜被抽离，留下不溶的细胞骨架结构， 经金属复型后可在电镜下观察细胞骨架的结构。

细胞生物学实验报告

实验三 细胞骨架的荧光染色

1 引言

1.1 实验目的

1. 了解荧光探针的基本知识

2．学习荧光显微镜的工作原理及使用方法

3.掌握细胞核和微丝骨架的标记技术

1.2 实验原理

细胞骨架：细胞骨架是真核细胞中由蛋白质聚合而成的三维的纤维状网架体系。细胞骨架包括微丝、微管和中间纤维。细胞骨架在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用。

鬼笔环肽是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反,只与聚合的微丝结合,而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后,抑制了微丝的解体,因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。Hoechst33342是一种亲脂性物质，能与DNA特异性结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞的观察和定量的研究。荧光激发和发射波长分别为350nm和461nm。

2 实验仪器、试剂及操作步骤

2.1 实验仪器

荧光显微镜、载玻片、盖片、滴管、滤纸、35mm细胞培养皿（六孔板）、湿盒

2.2 实验试剂

PEM缓冲液、0.5% Triton X-100、4%多聚甲醛、Hoechst.33342储存液:1mg/mL(溶于PBS)

55nM Alex-phalloidin（鬼笔环肽）

2.3 实验材料

鼠胚成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞

2.4 实验步骤

1.将原代培养的成纤维细胞放于于小盖玻片上，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中于37℃,5%CO2培养箱中培养至细胞融合度达70%～80%。

2.取出培养有细胞的小盖玻片，置于小平皿中用37℃预温 PEM轻轻漂洗3次。

3.加入37℃预温4%多聚甲醛固定15min 。

4.用37℃预温PEM漂洗3次。

5.加入0.5 % Triton X-100通透处理约10min。

6.用37℃预温 PEM漂洗3次。

7.取一个洁净的载玻片，按照载玻片的大小在其上放置一条封口膜，在封口膜上上滴加10ul 55nM