碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响农村生态环境2005,21(2):42—45RuralEco—Environment 碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响傅利剑,郭丹钊,史春龙,黄为一(南京农业大学生命科学学院微生物学系/农业部农业环境微生物工程重点开放实验室,江苏南京210095)摘要:碳源(甘油和柠檬酸钠)及碳氮比对纯培养的异养反硝化菌HP1(Pseudomono.salcaligenes)异养反硝化能力影响的试验表明,碳源种类对硝酸还原酶活性没有明显影响,对氧化亚氮还原酶活性有影响.批式培养方式下最适C/N为8,菌株HP1可以利用NO;作为唯一氮源进行反硝化作用,证明HP1至少有2种硝酸还原途径.连续培养方式下温度对菌株HP1异养反硝化作用中间产物的积累有影响,不同C/N时均有NH积累,C/N为3时还有NO;的积累.关键词:异养反硝化微生物;反硝化作用;碳源;C/N中图分类号:X172;Q935文献标识码:A文章编号:1001—5906(2005)02—0042—04 E岱ectofcarbonsourceandC/Nratioonheterotrophicdenitrificationofpureculture. F厶0n,GUODan—zhao,sHlChun—longHUANGWei—yi0DepartmentofMicrobiology,CollegeofLifeSciences,NanjingAgriculturalUni versity/KeyLaboratoryofMicrobiologicalEngineeringofAgriculturalEnvironment,Mini stryofAgriculture,Nanjing210095,China). RuralEco—Environment,20HD5,21(2):42—45Abstract:StrainHP1wasisolatedfromsedimentandidentifiedasPseudomonasa lcaligenes.Atestwascarriedouttode—termineeffectsofcarbonsourceandC/Nratioondenitrificationofpurecultur eResultsshowthatcarbonsourcehadlittleeffectonnitratereductaseactivity,butobviouseffectonnitrousoxidereduc taseactivity,TheoptimalC/Nratiowas8inbatchdenitrificationtests,andwithC/Nratiosbeing<8or>8,theN2Oco ncentrationwaslowerundertheconditionofa—cetyleneinhibitionThestudyshowthatStrainHP1couldgrowwithnitrateasits solenitrogensource.ItWasconfirmedthatnitratewaspartlyconsumedasnitrogensourcewhendenitrificationwascarrie dout,andStrainHP1hadtwokindsofnitratereductaseatleast.Therewerealotofintermediatesaccumulatedincontinuous cultureatdifferentC/Nratio.suchasni—trite.ammonium.Temperaturehadeffectontheaccumulationofintermediates. NitriteaccumulatedatC/Nratioof3butnonitriteaccumulatedatC/Nratioof20,Theobjectiveofthepresentstudywastop rovidemethodsforsubsequentresearch,Keywords:heterotrophicdenitrifier;denitrification;carbonsource;C/Nratio 反硝化作用是地球氮循环过程中一个重要的生物过程.它是在厌氧条件下,反硝化微生物利用氮氧化物作为电子受体,最终转化成氮气的生物过程J.由于这个生物学性质,反硝化作用在富营养化湖?白防治,高硝酸盐含量地下水治理和工业废水处理中已受到越来越多的重视,'..对某一特定的菌株而言,进行完整的反硝化作用是非常复杂的过程,包括一系列的还原反应和电子传递,受许多环境因素的影响,诸如O,温度,pH值,碳源(同时为异养反硝化微生物的电子供体),C/N(指碳源碳与硝态氮的摩尔比值,全文相同)等.各因素对微生物反硝化作用的影响是从不同方面体现出来的,有的影响酶的合成,有的影响酶的活性J.影响结果可从中间产物或终产物的形态,数量以及酶的合成情况上表现出来.目前, 国内对纯培养反硝化微生物的研究较少,本文研究了异养反硝化微生物的代谢特征,为高硝酸盐含量地下水的治理提供科学依据.1材料与方法1.1试验菌种菌株HP1(Pseudomonasalcaligenes),系南京农业大学/农业部农业环境微生物工程重点开放实验室分离自富营养化湖泊底泥.基金项目:上海市科技兴农重点攻关项目(农科攻字98第05—2号)收稿日期:2004—06—22?通讯联系人第2期傅利剑等:碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响431.2培养基1.2.1碳源测试培养基以Gihay培养基?中除碳源以外的其他成分作为基础培养基.加入待测碳源(甘油或柠檬酸钠), 最终碳浓度为50mol?L,.配制厌氧培养基时1L 培养基中加入1mL1.0g?L的刃天青指示剂和 0.3g半胱氨酸,在氮气保护下配制并分装到Hun. gate试管中.凡厌氧培养基,皆按此方法配制. 1.2.2碳氮比测试培养基批式培养测定:以甘油为碳源,设定甘油一C与 NO3-一N的比值(摩尔比)分别为3:1,6:1,8:1,10:1,20:1和50:1.连续培养测定:以柠檬酸钠为碳源, 设定柠檬酸钠一C与NO3--N 的比值(摩尔比)分别为3:l,20:1.流加培养基和批式培养基成分相同. NO;为氮源培养液:Giltay培养基中不加天冬酰胺, 其他成分相同.1.3试验设计柠檬酸钠是分离菌株HP1所选用的碳源,对菌株HP1进行碳源种类试验时,甘油处理组是所选碳源中反硝化作用最强的,所以在碳源测试中选用甘油和柠檬酸钠2种碳源.按上述要求配制好培养基后接人活化菌株HP1,在25?下培养,定时取样测定NO3--N,NO;-N,NH4+-N,加乙炔和不加乙炔时的N0.为测试碳源种类对氧化亚氮还原酶活性的影响,分别设置了加乙炔和不加乙炔处理组.它的原理是溶解于溶液中的乙炔可抑制氧化亚氮还原酶,使反应产生的中间产物N0积累而不被进一步还原为N,对参与反硝化作用的其他酶没有影响.通过比较2种处理N0的产量可以得出氧化亚氮还原酶的活性.C/N试验分别在批式和连 ?g$越蛏C续培养条件下进行.批式培养选用甘油为碳源,而连续培养选用柠檬酸钠为碳源,这是因为用甘油配制Giltay培养基易产生沉淀,不利于连续培养的操作.1.4方法恒化器的运行:稀释速率0.045h,,反应器置于设定温度下培养.NO;测定采用Cu.Cd柱还原法,NO;测定采用苯磺酸-盐酸一N一1.萘乙二氨比色法,NH;测定采用纳氏试剂比色法J.N,0测定采用气相色谱法J.生物量的测定:发酵液5mL, 10000r?min离心10min.取沉淀于105?下烘至恒重,以未接菌的空白培养基作对照. 2结果与讨论2.1碳源对菌株HP1异养反硝化作用的影响碳源对菌株HP1异养反硝化作用的影响见图 1.由图1可知,HP1利用柠檬酸钠或甘油为碳源, 在检测时间段内均有一定量的NO3-残留,变化范围在3.92,5.08mg?L,.NO2积累量也无明显区别,变化趋势一致.以柠檬酸钠为碳源时,NO;平均值为3.92mg?L,,以甘油为碳源时则为4.30 mg?L,.2种碳源条件下,NH4+的积累呈现明显不同的变化趋势,N0浓度的变化也有较大差别. 在不加乙炔抑制时,柠檬酸钠试验组检测不到N,0, 甘油试验组在12h为0.8mg?L,,随后开始下降, 到18h为0.13mg?L,.加乙炔抑制时,2处理组 N0浓度在前13h均呈上升趋势;在随后的时间内,柠檬酸钠试验组开始下降,到15h趋于平稳, N0浓度为14.5mg?L,.甘油试验组则一直呈上升趋势,到18hN0浓度达24mg?L,. 】5】6】7】812l3141516l7l8 t/ht/h十加乙炔N20;+不加乙炔N20;卜铵态氦;—矗一硝态氮;—*一亚硝态氮图1碳源对菌株HP1异养反硝化作用的影响Fig.1EffectofcarbonsourceOndenitrificationofStrain删一_一g),越蛏ez 一_?E),越蛏^_)z一一一?g),趟蛏+zz?加mO一{}g),越蛏^_)z一1l?量),越蛏e乙一,_l爿g),蛰蛏+}lz??柏?加m0?加mO农村生态环境第21卷上述结果表明,碳源种类对硝酸还原酶没有明显影响,但对氧化亚氮还原酶有影响.甘油为碳源时氧化亚氮还原酶活性在试验开始时较低,这表现在不加乙炔抑制时有N0被检测出,而以柠檬酸钠甘油为碳源时,加乙炔处为碳源时无N,0的积累.理组17h前N0浓度低于柠檬酸钠为碳源时的浓度,至17h后N0浓度持续上升,超过了柠檬酸钠为碳源时的浓度.作为异养反硝化菌株HP1的电子供体,甘油比柠檬酸钠的效果好.至于NH;的积累,可能是菌体自溶后释放而来的,也可能是还原产生的.在本试验中,由于测试时间短,后一种可能性较大.2.2批式培养时碳氮比对菌株HP1异养反硝化作用的影响异养反硝化作用所需作为电子供体的碳源的计算公式为:c(OC)=2.86c(NO3一N)+1.71c(NO;一N)+ c(DO)(1)式中,c(OC)所需有机碳浓度,mol?L,;c(NO3-一 N):处理水中硝态氮浓度,mol?L,;c(NO2-一N):处理水中亚硝态氮浓度,mol?L'.;c(DO):处理水中溶解氧浓度,mol?L,.由公式(1)可推导出在无氧条件下,反硝化作用所需碳与硝态氮和亚硝态氮之和的理论比值为4.6:1(摩尔比).在异养微生物生长代谢过程中,有机碳除作电子供体外,还作为碳源营养物用来合成微生物生长所需物质而被消耗, 所以实际需要的有机碳量大于由公式(1)计算出的理论比值(4.6:1).批式培养条件下碳氮比对菌株 HP1异养反硝化作用的影响见图2,试验结果符合上述推论.由图2可知,C/N为3:1时碳源不足, N0浓度低于其他试验组;当C/N为8:1时,N:0浓度在各试验组中最高;当C/N超过8:1时,N0浓度反而降低.可见在批式培养时HP1培养的最适 C/N为8:1.但为什么当C/N高于8时N0浓度反而下降呢?上述试验证实甘油对菌株HP1的异养反硝化没有明显抑制作用.菌株HP1在NO3为氮源的培养液中生长60h后氮的变化情况见表1.由表1可知,HP1可利用NO3作为唯一氮源进行异养反硝化作用.当C/N高于8时,碳源相对"过剩",要消耗部分NOr作为氮源,作为电子受体的N0相对减少,因此还原产生的N0量降低.由此可见,菌株 HP1对硝酸还原至少有2种途径.353025曼20,15烂10z5图2C/N对菌株HP1异养反硝化作用的影响Fig.2EffectofC/NondenitrificationofStrainHP1表1菌株HP1在NO;为氮源的培养液中生长60h后氮的变化Table1ChangeinnitrogenincultureofStrainHP1withnitrateasnitrogensourceafter60hoursmg?L2.3连续培养时碳氮比对菌株HP1异养反硝化作用的影响菌株HP1在连续培养中不同碳氮比时的生长情况见表2.表2菌株HP1在不同碳氮比连续培养中的生长情况Table2EffectofC/NongrowthofStrainHP1incontin-hOBSculture1)以十重计.由表2可知,连续培养时有大量NH4+生成,温度对其含量有明显影响,温度低时NH4+浓度高.由于试验设计的温度范围不足以导致氨的挥发,因此温度对NH4+生成的影响不是由氨的挥发引起的: 当碳氮比较低时(3:1),培养液中能检测到N0的存在,且温度高时NO2-浓度高;但在碳氮比为20:1 时则检测不到NO;.为何会有大量NH4+的积累? 原因尚不清楚.至于NO;积累的原因,有2种可第2期傅利剑等:碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响45 能:一是随着C/N降低,碳源相对不足,NO[浓度相对升高,可促进异养反硝化作用的进行,所以有异养反硝化作用的中间产物积累,Samuelson_l对pseud—olnol'l,o,sputrefaciens的试验有类似结果;二是批式培养试验证实当C/N为3:1时碳源成为限制性因素, 在连续培养时由于无法获得足够的碳源合成足够的反硝化酶系,所以有中间产物积累.在C/N为20:1 时情况恰好相反,因而检测不到异养反硝化作用的中间产物NO3结语不同的碳源种类是通过影响硝酸还原酶以外的其他酶来影响反硝化作用过程的,试验表明它至少影响了氧化亚氮还原酶的活性.在所选择的碳源中,甘油作为碳源时酶合成启动慢,但到l7h后 N,O浓度超过了柠檬酸钠处理组.C/N对反硝化作用的影响受培养方式,温度,所用碳源等多种因素的影响,需要通过多因子试验加以进一步验证. 反硝化作用是去除地下水中过量NO[的较好方法,但地下水中自然反硝化作用受各种条件的限制,如反硝化微生物的数量,碳源,氧气等,反硝化作用强度低.可将抽提的地下水通过生物反应器,向反应器中直接添加纯培养反硝化微生物和合适的碳源,控制C/N和溶氧量,最大限度地强化反硝化作用,将NO3-还原为N,减少中间产物的积累,达到显着去除NO;的目的.参考文献:[1]RevsbecbNP,S~brensenJDenitrifieationinsoilandsediment[2][3][4][5][6][7][8][9][1O][M].NewYorkandLondon:PlenumPress,1990:65—73ZayedG.WinterJ.Removaloforganicpollutantsandofnitrate fromwastewaterfromthedairyindustrybydenitrification[J].Appl MicrobiolBiotechnol,1998,49(4):469—474巩建华,柯尊伟,李季.河北省藁城市蔬菜种植区化肥施用与地下水硝酸盐污染研究[J].农村生态环境,2004,20(1):56—59Kesser0P,KissI,BihariZ,eta1.Biologicaldenitrificationina continuous?flowpilotbioreactorcontainingimmobilizedPseudo—ill~lbasbutanovoracells[J].BioresourceTechnol,2003,87(1): 75—8O BaumannB,vanderMeerJR,SnozziM,eta1.Inhibitionofdenitri. ficationactivitybutnotofmRNAinductioninParacoccu~denitrifi? 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