・１８・ 结核病与胸部肿瘤２０１２年第１期Ｔｕｂｅｒ＆Ｔｈｏｒ Ｔｕｍｏｒ，Ｍａｒ ２０１２，Ｎｏ．１
结核分枝杆菌ｔｈｙＡ基因突变与对氨基水杨酸钠耐药 关系的研究
孙勇 洪峰许绍发刘毅任卫聪孙照刚 高铁杰张治国 王廷民李传友
【摘要】 目的了解Ｍｔｂ临床分离菌株中对氨基水杨酸钠（ＰＡＳ）的耐药率及ＰＡＳ耐药性与ｔｈｙＡ基因突变的关系。方法从肺结核患 者的痰液或咽拭子标本中分离并鉴定Ｍｔｂ ９６株，采用比例法、ＰＣＲ的方法检测上述Ｍｔｂ临床菌株对ＰＡＳ的耐药性情况及其ｔｈｙＡ基因突变情 况。结果分离得到的９６株Ｍｔｂ中，６５株为ＰＡＳ敏感菌株和３１株为ＰＡＳ耐药菌株。以Ｍｔｂ标准菌株Ｈ３７Ｒｖ为对照，筛选敏感和耐药菌 株中的ｔｈｙＡ突变率分别是４６．１％（３０／６５）、７１％（２２／３１），突变多为单个碱基的缺失和插入突变，其中又以第１９位密码子缺失Ｃ、第１６８位 密码子缺失Ｃ为主，在耐药中所占比率分别是５４．８％（１７／３１）、２５．８％（８／３１），其在敏感菌株中的比率也分别是３５．５％（２３／６５）、１２．３％（８／６５）。 结论ｔｈｙＡ基因可能是ＰＡＳ耐药潜在靶点，但本研究未发现其特异性突变位点。 【关键词】分枝杆菌，结核；对氨基水杨酸钠；耐药；胸苷酸合成酶
Ａ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｔｈｙＡ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｒｅｓｉｓｔａｎｔａｎｃｅ ｔｏ Ｐａｒａ－ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ Ａｃｉｄ
Ｓｕｎ Ｙｏｎｇ ，Ｈｏｎｇ Ｆｅｎｇ，Ｘｕ Ｓｈａｏｆａ，Ｌｉｕ Ｙｉ，Ｒｅｎ Ｗｅｉｃｏｎｇ，Ｓｕｎ Ｚｈａｏｇａｎｇ，Ｇａｏ Ｔｉ￣ｉｅ，Ｚｈａｎｇ Ｚｈｉｇｕｏ，Ｗａｎｇ Ｓｕｍｉｎ， Ｌｉ Ｃｈｕａｎｙｏｕ Ｉ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｔｕｍｏｕｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０１ １４９，Ｃｈｉｎａ．
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｚｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｏ ｐａｒａ－ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＰＡＳ） ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＰＡＳ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｙＡ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９６ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ ｓｐｕｔｕｍ ｏｒ ｔｈｒｏａｔ ｓｗａｂ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｆｒｏｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｆｏｒ ＰＡＳ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｙＡ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｍｏｎｇ ９６ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，６５ｗｅｒｅＰＡＳ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓａｎｄ ３１ ＰＡＳ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ ｓｔａｎｄ￣ｄ ｓｔｒａｉｎｓＨ３７ＲｖＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｗａｓ ａｓ ａ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｔｈｙＡ ｇｅｎｅ ｍｕｍｆｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ４６．１％（３０／６５）ａｎｄ ７１％（２２／３１），ｍｏｓｔｌｙ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｗｈｉｃｈ ｍａｉｎｌｙ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｍｉｓｓｉｎｇ ａｔ ｃｏｄｏｎ １９ Ｃ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｔ ｃｏｄｏｎ １６８ Ｃ．Ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ５４．８％（１７／３１），２５．８％（８／３１）ａｎｄ ３５．５％（２３／６５），１２．３％（８／６５）ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＴｈｙＡ ｇｅｎｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＰＡＳ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｂｕｔ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｈａｓ ｎｏｔ ｂｅｅｎ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｐａｒａ—ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ；Ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ
目前，结核病仍是最常见的传染病之一，全世 界约有２亿人感染结核分枝杆菌，其中仅２０１０年新 增８８０万患者，１４０万人死于结核病 ”。近年来，
由于不合理的用药及新药研发的缓慢导致ＭＤＲ—ＴＢ （至少对ＩＮＨ、ＲＦＰ耐药的结核病）的患者的增多
及结核病防控的困难。２０１０年我国的结核患者中有 ５．４％为ＭＤＲ—ＴＢ患者 ”。由于结核分枝杆菌对一
线药物的耐药，人们开始更多关注二线抗结核药物，
基金项目：首都医学发展基金（２００９—１０５５） 作者单位：１０１１４９北京，首都医科大学附属北京胸科医院细菌免疫学研究室（孙勇、刘毅、任卫聪、李传友），胸外科（许绍发） １０００３５北京，北京结核病控制研究所（洪峰、王 民）； １０２２００北京，北京市昌平区结核病防治所（高铁杰、张治国） 通讯作者：李传友，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｃｈｕａｎｙｏｕ６６８８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ；王筵民，Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｕｍｉｎｗａｎｇ０８５＠１２６．
ｃｏｍ 结核病与胸部肿瘤２０１２年第１期Ｔｕｂｅｒ＆Ｔｈｏｒ Ｔｕｍｏｒ，Ｍａｒ ２０１２，Ｎｏ．１
并与一线抗结核药联合应用，但随着应用的二线药
物如喹诺酮类药物、卡那霉素、卷曲霉素等二线药
物的耐药出现，人们又开始寻找那些对Ｍｔｂ有抑制 或杀菌作用而应用不是很广泛的药物，其中对氨基
水杨酸钠ｐａｒａ．ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＰＡＳ）是重要的二
线抗结核病药物之一，但对其作用机制及耐药机制
尚不十分清楚。
ＰＡＳ对Ｍｔｂ有抑制作用，一般认为ＰＡＳ与对氨 基苯甲酸（ＰＡＢＡ）近似，通过对叶酸合成的竞争抑
制作用而抑制Ｍｔｂ的生长繁殖 。Ｒｅｎｇａｒａｊａｎ等
在卡介苗菌株中利用转座子插入的方法，发现编码
胸苷酸合成酶（ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｔｈｙＡ）的基因突
变抑制了酶的活性导致细胞内叶酸水平的下降，其
认为ｔｈｙＡ基因突变不仅导致ＰＡＳ耐药而且还是其 他和叶酸代谢相关药物的靶点。Ｒａｔｌｅｄｇｅ等口 认为
ＰＡＳ抑制了Ｍｔｂ对铁离子的吸收，从而导致Ｍｔｂ生 长受限及毒力的减弱。由于ＰＡＳ不是临床首选药，
应用的相对较少，对其耐药的研究更少，目前认为 ｔｈｙＡ基因的突变导致了ＰＡＳ耐药［２】。本文通过全
基因测序测定ｔｈｙＡ基因，了解６５株ＰＡＳ敏感菌株 和３１株ＰＡＳ耐药菌株ｔｈｙＡ基因突变情况，分析了
ＰＡＳ耐药与ｔｈｙＡ基因突变的关系，探讨ＰＡＳ耐药
分子机制，为建立快速耐药检测方法及指导临床医 生合理用药提供科学依据。
１材料与方法
１．１ 材料
１．１．１临床菌株来源 本实验所用北京地区９６株Ｍｔｂ临床分离株来
源于２００８～２０１０年北京市结核病控制研究所和北
京市昌平区结核病防治所，采集的痰标本按照《结
核病诊断实验室检验规程》进行Ｍｔｂ的培养、菌种 鉴定，采用比例法测定药物敏感实验Ｈ】。标准菌株
Ｈ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ２５６１８）为本室保存。
１．１．２主要仪器设备 Ｂｉｏ—ｒａｄ Ｓ１０００基因扩增仪（美国Ｂｉｏ．ｒａｄ公
司），ＦｏＴｏＤＹＮＥ凝胶成像系统（美国Ｉｍａｇｅ公司），
Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００核酸分析仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司），
ＥＳＣＯ ＩＩ生物安全柜（新加坡ＥＳＣＯ公司）。 １．２方法
１．２．１细菌基因组ＤＮＡ的抽提：采用酚／氯仿抽提
的方法 。
１．２．２ ＰＣＲ扩增：ｐｒｉｍｉｅｒ ５．０设计引物上游５’ＧＧＴＧＴＣＧ．
ＧＴＧＧＴｒＴＴＣＧＧＣＡＴ３’下游５’ＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＴＣ． ＧＴＣＡＣＡＣ３’扩增全长１０６０ ｂｐ，其中包含ｔｈｙＡ基因（７９２
ｂｐ）。采用５０ｕ１体系，包括２￥ＰＦＵ ＤＮＡ聚合酶（北京 Ｇｅｎｅｒａｙ公司）２５１￣１，上下游引物各０．４￣ｍｏｌ／ｌ，１ｕ１模板，
双蒸水２２ｔ￣１。反应条件９４￣Ｃ预变性５ ｍｉｎ，９４￣Ｃ变性３０
Ｓ，６２℃退火４０ Ｓ，７２℃延伸２＿３ ｍｉｎ，最后７２℃延伸５
ｍｉｎ，３５个循环。
１．２．３ ＰＣＲ纯化：ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶中电
泳，用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒（杭州Ａｘｙｇｅｎ公司） 回收ＤＮＡ扩增片断，分别送北京擎科新业和北京 金唯智生物科技公司测序。Ｈ３７Ｒｖ的标准序列来自
结核数据库网站 】。采用ＤＮＡＭＡＮ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．２．２软 件进行序列比对。
１．３统计分析数据采用ＳＰＳＳ １０．０进行统计分析， 组间比较采用ｘ 检验，Ｐ＜Ｏ．０５为差异有统计学意义。
２结果
２．１ Ｍｔｂ培养、鉴定及药物敏感结果分离得 到９６株痰培养阳性菌株并进行鉴定和药物敏感实
验（表１）。全部鉴定为Ｍｔｂ，耐ＰＡＳ菌株３１株
（３２．３％），敏感菌株６５株（６７．７％），耐药与敏感菌
株的患者男性与女性差异无统计学意义（ｘ ＝０．３８１， Ｐ＞０．０５）；耐药与敏感菌株患者中初治耐药比例分别
达到了７１％、８６．２％，但两者差异并没有统计学意
义（ｘ ＝３．１７７，Ｐ＞０．０５）；同时北京常驻人口与外地
流动人员相比较耐药与敏感菌差异没有统计学意义
（ｘ ：０．０３７，Ｊｐ＞０．０５）。
表１ ９６株Ｍｔｂ药物敏感性结果【ｎ（％）】
耐药
敏感
合计 ３１（３２ ３、
６５（６７．７）
９６ １９（６１．３）
４４（６７．７
６２ ９（２９．Ｏ、
９（１３．８１
ｌ８
