第二章菌种选育与构建

的水生环境中生长
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。

多次传代 摇瓶初筛
诱变育种的 基本程序
挑出高产斜面菌种 保藏菌种 (砂土管、冻干 管或制备固体孢子)
对照组 摇瓶复筛 (复筛次数及摇瓶数以及培养基种类
根据情况决定 )
挑出高产菌株作稳定性试验和菌种特性考察
放大试验罐，中试考察
大型投产试验
诱变育种基本程序的要点说明
（1） 出发菌株的选择 （2）单孢子悬液或单菌悬液的制备 （3）诱变剂的种类及剂量选择 （4）突变菌株的分离纯化与初筛 （5）优良突变菌株的筛选
菌株选育概述
生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 不会有代谢产物的积累
解除或突破微生物的代谢调节控制 目的产物大量积累
微生物育种的目的
菌株选育概述
菌株选育目的：
z 防止菌种退化； z 提高生产能力； z 提高产品质量； z 开发新产品
菌株选育概述
方法：
基因突变：自然选育、诱变育种； 基因重组：体内----- 杂交、原生质体融合技术；
• 出发菌株的选择
（1）考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能 力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物 的催化酶系的基因。
（2）出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生 长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。
•菌悬液制备
• 一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定 的措施促使细胞处于同步生长。
• 悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会 均等并充分地接触，避免出现不纯的菌落，给 后续的筛选工作造成困难。
频率极低
2.3.2.原生质体融合技术
将遗传性状不同的两种菌(包括种间、 种内及属间)融合为一个新细胞的技术。
步骤
选择亲株、原生质体的制备、原生质体 的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤

卡那霉素产生菌经诱变后，由产生卡那 霉素A变成产卡那霉素B。
发酵工程
理想的产生菌应符合以下要求 (1)遗传性状稳定； (2)生长速度快，不易污染； (3) 物质转化率高； (4)目标产物分泌到胞外； (5) 产物类似物少； (6)对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不
敏感； (7)对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。
发酵工程
二、诱变方法
1、诱变方法： 物理诱变 化学诱变
发酵工程
1）物理诱变剂： 射线如紫外线 X—射线 γ—射线 快中子
发酵工程
2）化学诱变剂： 化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化
剂等。 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。
发酵工程
三、诱变育种步骤
操作步骤： •出发菌株的选择 •处理菌悬液的制备 •诱变处理 •中间培养 •筛选
发酵工程
第一节 工业微生物的育种
工业微生物的育种： 运用遗传学原理和技术对某个用于特定
生物技术目的的菌株进行的多方位的改 造。通过改造，可使现存的优良性状强 化，或去除不良性质或增加新的性状。
发酵工程
一、工业育种简介
1.工业菌种育种的方法 自然育种 诱变育种 杂交育种 基因工程育种
发酵工程
第二节 自然选育
自然选育指在生产过程中，不经 过人工处理，利用菌种的自然突变 而进行菌种筛选的过程。
发酵工程
自然选育的作用：
自然选育在工业生产中可以达到纯化菌 种，防止菌种衰退，稳定生产，提高产 量的目的。
发酵工程
自然选育最为成功的例子是目前被 广泛使用的卡介苗(BCG vaccine)。法国 的卡尔密脱(Calmette)和介林(Guerin)把 牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘 油、马铃薯培养基上，连续传代培养230 代，前后经历13年时间，终于在1923年 获得显著减毒的结核杆菌----卡介苗。

李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
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新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
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新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
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（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。