高效液相色谱法快速检测水产品中甲醛的方法

高效液相色谱法快速检测水产品中甲醛的方法 建立水产品中甲醛的高效液相色谱快速测定方法。方法 样品中甲醛直接与2，4—二硝基苯肼在60℃水浴中15min生成2，4—二硝基苯腙衍生物，对其衍生物进行高效液相色谱测定，以甲醇：水（70：30）作为流动相，经C18色谱柱分离，峰面积定量。结果 在本实验条件下甲醛线性范围为8μg/ml～128μg/ml线性关系良好r=0.9998，回归方程y=0.419x+ 0.974；检出限为0.75mg/ml准确度实验加标回收率为93.1%～96.2%；相对标准偏差为0.27%。结论 本法处理样品简单、快速、灵敏度高、重现性好，适合水产品中甲醛含量的测定。

甲醛（Formaldehyde）别名蚁酸，分子式CH2O，分子量30.03，是一种无色有刺激味的液体，易溶于水、醇和醚，具有消毒杀菌和防腐能力。天然存在于肉类、家禽、鱼、水果、牛奶、奶酪等食品中，含量在0.5～30mg/kg之间。发酵酒生产过程中限量使用甲醛。啤酒甲醛含量为0.08～1.17mg/L,白酒甲醛含量为0.40～2.37mg/L。 甲醛属于有毒有害物质，我国禁止在国家标准以外的食品中以任何形式添加甲醛。但甲醛具有防腐性能，将甲醛加入水产品和不易储存的食品中，能起到保鲜防腐的作用，甲醛溶液浸泡过的水产品不仅能使其外观变的比较好看，也能延长保存时间，还能增加机体组织的脆性，改善水产品的口感，导致违禁使用甲醛的现象依然普遍存在。各国已研究制定了行业标准，世卫组织还将甲醛列为可疑的致癌物质。所以建立快速测定水产品中甲醛方法十分重要。 目前测定甲醛的方法有多种比色法[1,８]气相色谱法[9]、高效液相色谱法[10]随着科技水平和仪器水平的高速发展高效液相色谱仪已在分析领域达到普及的程度。本文在文献[8]水产品中甲醛测定方法的基础上对方法进行了改进。本法优点为样品前处理过程中取消了繁琐的水蒸气蒸馏，二氯甲烷提取、挥干、用甲醇溶残渣的过程。减少了有机溶剂的使用，降低了检验成本和对检验人员的危害；在样品测定过程中，改变流动相比例使样品测定时间加快；本文的方法比原有方法步骤更加简单、快速。另外还对实验条件进行了优化，通过二极管阵列检测器检测进行光谱比，选择最大吸收波长，提高了分析的灵敏度；对甲醛与2，4—二硝基苯肼生成的衍生物甲醛2，4—二硝基苯腙的稳定性在常温下进行观察，该衍生物可稳定4天。确定了2，4—二硝基苯肼在本方法中浓度、用量，衍生甲醛的范围，在本实验条件下甲醛含量为8μg/ml~128μg/ml的样品中。若样品中甲醛浓度在本实验条件下大于128μg/ml应改变2，4—二硝基苯肼浓度或用量。因此通过本研究拟建立一种快速、准确的高效液相色谱法测定水产品中甲醛的方法，现将研究结果报告如下。 1实验方法 1.1仪器和试剂 高效液相色谱仪：Ultimate3000泵Ultimate3000 Photodiode Array 检测器；电动匀浆机；离心机；恒温水浴锅。 21.9%乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3ml冰乙酸，加水溶解并稀释至100ml；10.6%亚铁氰化钾：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100nL；0.2% 2,4—二硝基苯肼溶液：称取0.2g 2,4—二硝基苯肼溶解于24ml浓盐酸中，加水定容至100ml；0.1mol/L碘溶液；1mol/L氢氧化钠溶液；1%硫酸；0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液；0.5%淀粉指示剂；甲醛标准储备溶液：吸取0.3ml含量为36～38%甲醛溶于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，冷藏保存两周后标定。标定方法为碘量法：吸取甲醛标准储备溶液10.00ml置于250ml碘量瓶中，加入25.0ml0.1mol/L碘溶液,7.5ml1mol/L氢氧化钠溶液，放置5min，加入10ml1%硫酸，放置15min，用0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色时加入1ml0.5%淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为终点，记录硫代硫酸钠标准溶液所消耗体积为V1（ml）。同时做空白试验，空白所消耗硫代硫酸钠标准溶液体积为V0（ml）。计算甲醛标准储备溶液浓度公式为： ( V0－V1)×C×15×1000 10 X1= 式中：X1—甲醛标准储备溶液浓度，单位为毫克每升（mg/L）； V0－滴定空白消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，单位为毫升（ml）； V1－滴定甲醛消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，单位为毫升（ml）； C —硫代硫酸钠标准溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； 15 —1ml0.1mol/L碘溶液相当于甲醛的浓度，单位为毫升（ml）； 10 —滴定时所取甲醛标准储备溶液的体积，单位为毫升（ml）。 1.2实验方法 1.2.1 色谱条件 色谱柱：AngelaC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱温：30℃；流动相：甲醇+水（70+30）；流速：1.0ml/min；波长：354nm。 1.2.2 标准曲线的绘制 将甲醛标准储备溶液用水稀释成200μg/ml的甲醛标准应用液，分别取此液0.20、0.40、0.80、1.60、3.20ml于5ml比色管中加水至4.0ml,加入0.2ml2，4—二硝基苯肼,在60℃恒温水浴中，加热15min,取出后迅速于冷水浴中冷却，加乙醇至5ml（其标准系列的浓度为8.0、16.0、32.0、64.0、128μg/ml），经0.45μm滤膜过滤后供液相色谱仪进样用，标准进样体积为1μL（V5）。 1.2.3样品处理 精密称取用电动匀浆机匀浆后的样品0.500g于10ml比色管中加入21.9%乙酸锌溶液0.5ml, 10.6%亚铁氰化钾溶液0.5ml加水至刻度（V1），混匀，静置待分层后，2000转/分离心10min ，取上清液1.0ml(V2)置于5.0ml比色管中补充水至4.0ml,加0.2%2，4—二硝基苯肼0.2ml在60℃恒温水浴中，加热15min,取出后迅速于冷水浴中冷却后，加乙醇至5ml(V3)，混匀，经0.45μm滤膜过滤后供液相色谱仪进样用，样品进样体积为8μL（V4）。

1.2.4 测定及计算 甲醛标准系列和样品分别由仪器自动进样，通过戴安色谱工作站处理数据，根据保留时间和光谱比对确认定性，样品测定的色谱面积峰定量。同时获取标准曲线，相关系数和测定结果，在标准曲线上查出样品中相当于甲醛标准的量，结合所取的样品重量及其测定步骤中定容的体积，计算出样品中甲醛的含量，计算公式为： C ×V1× V3× V5 W × V2×V4 X= 式中：X—样品中甲醛含量（mg/kg）；C—样品测定液中查标准曲线得到的相当于标准的含量（μg /ml）；V1—样品定容体积（ml）；V2 —样品衍生时所取体积（ml）；V3—样品衍生后定容体积（ml）；V4—样品进样体积（μL）；V5—标准进样体积（μL）。 2 结果与讨论 2.1 样品处理条件的选择 2.1.1 前处理方法的选择 按文献[8]水产品中甲醛的测定方法，样品前处理过程为样品经水蒸汽蒸馏、收集馏出液、取馏出液加2，4—二硝基苯肼，在 60℃恒温水浴中，加热15min衍生、用二氯甲烷提取三次、挥干二氯甲烷、用甲醇溶残渣，此方法步骤工作量大、即费时又繁琐。本实验分别采用两种方法对样品进行处理。第一种方法：直接取样品无需水蒸汽蒸馏，加乙酸锌、亚铁氰化钾沉淀蛋白后，离心取上清液加2，4—二硝基苯肼于60℃水浴中加热15min衍生、用二氯甲烷提取、挥干、溶残渣；第二种方法：直接取样无需水蒸汽蒸馏，加乙酸锌、亚铁氰化钾沉淀蛋白后，离心取上清液加2，4—二硝基苯肼于60℃水浴中加热15min衍生、用乙醇定容。两种样品处理方法在本实验中结果非常一致，但第二种方法更加简单快速，不使用二氯甲烷可减少对实验人员的危害，故本法选择直接取样加2，4—二硝基苯肼60℃水浴中加热15min衍生、用乙醇定容的样品处理方法。 2.1.2 定容溶剂的选择 在样品处理过程中分别用甲醇和乙醇定容衍生后的甲醛2，4—二硝基苯腙，并用甲醇和乙醇两种溶液做了空白实验，实验证明甲醇和乙醇对测定均无影响，故选择毒性低的乙醇为定容液体，即降低成本又减少了对检验人员的危害。 2.1.3 衍生剂用量的选择 2，4—二硝基苯肼作为衍生剂与甲醛生成甲醛2，4—二硝基苯腙，通过实验观察到2，4—二硝基苯肼的浓度和用量对甲醛衍生有一定范围，在本实验中选择了甲醛浓度范围为8μg/ml～128μg/ml，若测定样品中甲醛浓度大于128μg/ml结果偏低，应加大2，4—二硝基苯肼的浓度、使用量或稀释测定样品以达到最佳的测定结果。故在本实验条件下本法选择2，4—二硝基苯肼浓度为0.2%，用量为0.2ml。 2.2 色谱条件的选择 2.2.1 检测波长的选择 按本法将甲醛与2，4—二硝基苯肼衍生成甲醛2，4—二硝基苯腙后进行测定，在光谱图上观察到其最大吸收波长为354nm，故本法选择测定波长为354nm。 2.2.2 流动相的选择 采用甲醇与水的比例为80：20、70：30、60：40，作为流动相进行比较第一种比例流动相对样品分离效果不理想，甲醇：水的比例为60：40虽分离效果佳，但分析所需要时间为15min,；甲醇与水比例为70：30时分析时间只需要10min不仅分离效果好，测定效率也提高了，故选择甲醇与水的比例为70：30作为流动相。 2.3 衍生产物的稳定性 为获得甲醛与2，4—二硝基苯肼生成甲醛2，4—二硝基苯腙衍生物的稳定性，取同一浓度的甲醛标准溶液衍生后在0、8、24、48、72、94h后测定，其结果在94h内基本无变化。 2.4标准曲线线性范围和方法检出限 在本实验条件下配制标准系列以甲醛浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程y=0.419 x+ 0.974 ，r=0.9998,最佳线性范围8μg/ml～128μg/ml 方法检出限以3倍噪声基线在标准曲线上查出所对应的甲醛浓度再根据计算公式中样品在实验过程中的量值关系计算出本方法的检测线为0.75 mg/kg 2.5 方法精密度 取同一样品7份，按本实验方法操作步骤进行测定，考察样品中甲醛测定结果的精密度，相对标准偏差为0.27%。 2.6 方法准确度 分别称取9份同一样品，加入8μg/ml、32μg/ml、64μg/ml三个不同水平的标准溶液，进行加标回收实验，结果见表1。本法平均回收率在93.12%～96.23%之间。 2.8与标准方法进行比较 用本法与SC/T3205-2006中华人民共和国农业部标准方法进行比较，结果见表2用配对t检验进行统计分析，测定结果差异无统计学意义（t=1.02，P＞0.05 ）由实验结果可见两种方法测定结果基本一致。表明本法测定结果可靠。