高产微生物油脂菌株培养基及发酵条件优化方法
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发酵工程第一章发酵工程:是现代生物学的重要组成部分、由早期的酿造工艺演化至今,已经进入高科技领域,是生物科学的重要领域。
发酵:指厌氧发酵产生co2气体的现象。
生理意义:微生物在无氧环境下的一种呼吸,是微生物获取能量的一种方式。
发酵工程的发展阶段:第一阶段:天然发酵阶段19世纪中叶之前列文虎克—显微镜、巴斯德—巴氏消毒第二阶段:纯培养技术(19世纪末至20世纪30年代)乳酸的发酵科赫—细菌培养技术第三阶段:通气搅拌发酵技术的建立亚历山大·弗莱明—青霉素第四阶段:代谢控制发酵和现代发酵工程技术发展发酵工业特点:优点:1、产物结构的特异性和复杂性2、产物过程的安全性3、主要原料的可再生性4、原料的可替换性5、反应的自控性6、副产物的可综合利用性7、生产能力的可提高性8、设备的可通用性9、产物类型的可塑性缺点:1、副产物多、分离精制困难2、反应速度慢3、原料转化率低4、反映浓度低5、生产稳定性差6、设备庞大、辅助设备多7、废水废渣多8、生产过程中容易污染9、通气搅拌冷却,耗能大生产流程1.繁殖种子和发酵生产所用的培养基组分确定2.培养基加发酵罐及其他设备的灭菌3.接种4.在最适环境下经行发酵培养5.产物萃取和精制由实验室研制到产业化的过程菌种筛选—摇瓶实验—发酵罐中试—发酵生产思考题发酵的定义:微生物在无氧环境下的呼吸,是微生物获取能量的一种方式发酵工程的定义:使用现代技术手段,利用微生物某些特定功能为人类生产产品,或是直接把微生物利用于工业生产中的一项技术。
发酵的流程:1.繁殖种子和发酵生产所用的培养基组分确定2.培养基加发酵罐及其他设备的灭菌3.接种4.在最适环境下经行发酵培养5.产物萃取和精制发酵的分类:按照能量获取:好氧发酵、厌氧发酵产物类型:初级代谢产物发酵、次级代谢产物发酵、食品发酵、有机酸发酵、氨基酸发酵、维生素发酵、抗生素发酵操作类型:自然发酵、纯种发酵、混种发酵、分批发酵、半连续式发酵、连续发酵、固态发酵、液态发酵。
毕业论文开题报告生物工程高产灵菌红素菌株培养条件优化1 选题的背景和意义随着社会的发展和人们生活水平的提高,合成色素对人体健康的危害越来越引人注目。
大量的研究报告指出,几乎所有的合成色素都不能向人体提供营养物质,某些色素还会危害人体健康。
其中的危害包括一般毒性、致泻性、致突性(基因突变)和致癌性。
因此合成色素作为食品添加剂的用量越来越少,甚至被众多国家禁止使。
而天然色素具有安全、无毒、色泽亮丽诱人,尤其是一些天然色素本身就是人们日常饮食的成分,有一定的营养价值和药理保健作用,因此倍受人们的瞩目。
现今,天然色素(prodigiosins)的种类并不多,灵菌红素就是天然色素之一,具有吡咯环结构。
灵菌红素有一定的免疫活性,如抑制真菌、细菌和霉菌等功效,且具有一定的抗肿瘤作用,因此具有很大的药用价值。
除此之外,灵菌红素在纺织染色方面也比其他染料有优势,受到科研工作者和企业家的极大关注,具有创造巨大经济价值的潜力。
目前,主要是通过微生物发酵来获得灵菌红素,能产生灵菌红素的微生物主要有链霉菌属(Streptomyces)、沙雷氏菌属(Serratia)和假单胞菌(pseudomonas)等种属。
其中又以沙雷氏菌属生产灵菌红素最受关注,报道也最多。
但是,利用微生物发酵的灵菌红素还存在很多问题,例如产灵菌红素的菌种不稳定,产量较低和成本偏高等。
因此,本实验便是以一株产红黏质沙雷氏菌为出发菌株,通过优化培养基组成及成分配比,使用低成本的农作物或工业废弃物来生产和提高灵菌红素的产量,降低生产成本。
2 相关研究的最新成果及动态近年来灵菌红素的在医学、环境治理,纺织染色以及食品上的应用越来越广泛,具有很高的利用价值。
根据灵菌红素的抗肿瘤、免疫抑制活性、抗菌、抗疟疾活性等作用,在医学上有巨大的发展潜力。
但是,灵菌红素的医学作用机理还不是很清楚,但大体上分为三个方面来作用细胞:第一、灵菌红素能引发铜离子诱导的双链DNA的裂解与其分子中A环的结构密切相关,完整的双吡咯环发色团结构灵菌红素显现铜介导的核酸酶活性的关键。
生物技术进展2022年第12卷第1期112~119Current BiotechnologyISSN 2095‑2341研究论文Articles高产中性蛋白酶菌株的筛选、优化及中试放大张文静1,佟晔2,杨锡文1,曹彦金1,魏计东1*1.基因赛奥(大连)生物科技发展有限公司,辽宁大连116620;2.大连市现代农业生产发展服务中心,辽宁大连116014摘要:为筛选分离得到具有高产中性蛋白酶能力的菌株,同时研究菌株的发酵条件,在牛粪、猪粪堆肥时期采集样品,在以干酪素为唯一碳源的固体培养基上筛选分离得到19株产蛋白酶菌株。
选取其中1株产酶效果最好的菌株PC2,其水解圈D/d 值为4.25,酶活为10.74U ·mL −1。
结合形态学、生理生化以及16S rDNA 分子生物学鉴定结果,认定其为枯草芽孢杆菌,革兰氏阳性菌。
进一步对其进行摇瓶和中试放大条件优化,LB 培养基37℃活化24h ,干酪素发酵培养基30℃发酵48h ,转速为180r ·min −1。
中试放大具体参数:50L 种子罐180~240r ·min −1,通气量20~30L ·min −1。
500L 发酵罐:添加1%小麦蛋白粉,100~180r ·min −1,通气量10~25L ·min −1。
发酵结束活菌含量44.58亿·mL −1,酶活29.48U ·mL −1,是初始值的2.745倍。
研究结果可为探究含中性蛋白酶菌株的微生物菌剂奠定理论基础,并指导工业化菌剂的生产。
关键词:蛋白酶;细菌;鉴定;发酵条件优化;中试放大DOI :10.19586/j.2095‑2341.2021.0166中图分类号:Q556+.9,TQ925.2文献标志码:AScreening and Optimization of High‑yield Neutral Protease‑producing Strains and Pilot Scale‑upZHANG Wenjing 1,TONG Ye 2,YANG Xiwen 1,CAO Yanjin 1,WEI Jidong 1*1.Genesino (Dalian )Biological Science and Technology Development Co.,Ltd ,Liaoning Dalian 116620,China ;2.Dalian Modern Agricultural Production Development Service Center ,Liaoning Dalian 116014,ChinaAbstract :In order to screen and isolate a strain with high -yield neutral protease ability and study the fermentation conditions of the strain ,we collected samples during the composting period of cow manure and pig manure ,and 19protease producing strains were screened and isolated on solid medium with casein as the sole carbon source.One of the strains PC2with the best enzyme -producing effect was selected.Its hydrolysis circle D/d value is 4.25,and the enzyme activity is 10.74U ·mL −bined with the results of morphology ,physiology and biochemistry ,and 16S rDNA molecular biology identification ,we identified it asBacillus subtilis ,and it is a Gram -positive bacterium.In the follow -up ,we optimized the conditions of shake flask and pilot scale -up ,which were activated with LB medium at 37℃for 24h ,and fermented with casein fermentation medium at 30℃for 48h at a speed of 180r ·min −1.In the specific parameters of the pilot scale -up ,the speed of the 50L seed tank was 180to 240r ·min −1,and the aeration rate was 20to 30L ·min −1.Add 1%wheat protein powder to the medium of the 500L fermenter ,the rotation speed was 100to 180r ·min −1,and the aeration rate was 10to 25L ·min −1.After fermentation ,the viable bacteria content of PC2was 4.458billion ·mL −1,and the enzyme activity was 29.48U ·mL −1,which was 2.745times of the initial enzyme activity.The results of this study can lay a theoretical foundation for exploring microbial agents containing neutral protease strains and guide the industrial production of microbial agents.Key words :protease ;bacteria ;identification ;optimization of fermentation conditions ;pilot scale -up收稿日期:20211011;接受日期:20211125联系方式:张文静E -mail:****************;*通信作者魏计东E -mail:*******************张文静,等:高产中性蛋白酶菌株的筛选、优化及中试放大我国是农业大国,为了提高农作物产量,已研究出了不同种类的化肥,但同时也导致了化肥盲目、过度施用、利用率低等问题。
产多糖菌的筛选及其发酵条件研究微生物多糖可由微生物进行大规模发酵生产,因此可以降低多糖的生产成本,并有可能获得具备特殊性能的多糖。
本研究从海水和海藻取样,获得6株可能具备产多糖能力的菌种,然后进行摇瓶复筛,B1号菌的多糖产量最大,因此选择B1号菌进行进一步的发酵条件优化研究。
当发酵温度为25℃时,多糖产量达到最高。
发酵接种量对发酵的影响较小,接种量为5%时,多糖产率最高,接种量继续增加,多糖的产量有所下降,且最终确定发酵36小时为最佳的发酵时间。
标签:微生物多糖;产多糖菌株;发酵条件优化1 概述多糖是一类天然大分子物质,由于具备优良的生物活性,大量的活性基团,因此在众多研究领域有广泛的应用[1][2][3]。
微生物多糖是由微生物在发酵过程中产生,具备各种不同的生物活性,已经在抗肿瘤,抗感染以及石油化工等领域有了诸多的应用,并可以作为各种化学品,如絮凝剂,保鲜剂等在食品、医药、化工领域等发挥作用[4][5]。
从海洋中筛选获得产多糖微生物,目前也是产多糖微生物研究领域的研究热点,在本课题中,以海水和秦皇岛海域野生海藻进行取样,筛选出产多糖的海洋微生物,并对该产多糖微生物的多糖发酵条件进行研究,获得最佳的发酵条件,为多糖微生物的筛选及发酵研究提供了新的研究思路。
2 材料与方法2.1 培养基筛选固体培养基:酵母粉5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,琼脂20g/L。
搖瓶液体培养基:蛋白胨5g/L,葡萄糖5g/L,K2HPO3 2g/L。
2.2 试验方法2.2.1 产多糖菌的筛选从海水及海藻取样。
各自称量约10g海水和海藻块,溶解于无菌水中,磁力搅拌作用得到菌悬液。
分别标记为A和B。
吸取稀释液均匀涂布到已经灭菌的筛选固体培养基上,进行培养。
观察菌落形态,选择粘稠菌落进行划线分离纯化保藏。
将活化后的菌种接种到液体摇瓶培养基中,转速为150r/min,震荡培养48小时,选择胞外多糖含量最大的菌种为后续研究菌种。
第六章微生物发酵制药工艺6.1 微生物发酵与制药6.2 微生物生长与生产的关系6.3 微生物生产菌种建立6.4 发酵培养基制备6.4 发酵培养基制备• 概念(medium)供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。
• 培养基的组成和比例是否恰当,直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。
6.4.1 培养基的成分碳源氮源无机盐水生长因子前体与促进剂消泡剂1、碳源(carbon sources)概念:构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。
作用:为正常生理活动和过程提供能量来源,为细胞物质和代谢产物的合成提供碳骨架。
碳源种类糖类:葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪:豆油、棉籽油和猪油醇类:甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类:蛋白胨、酵母膏速效碳源:糖类、有机酸迟效碳源:酪蛋白水解产生的脂肪酸2、氮源(nitrogen sources)概念:构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。
作用:为生长和代谢主要提供氮素来源。
种类:无机氮源、有机氮源有机氮源几乎所有微生物都能利用有机氮源黄豆饼粉、花生饼粉棉籽饼粉、玉米浆、蛋白\胨、酵母粉、尿素无机氮源氨水、铵盐和硝酸盐等。
氨盐比硝酸盐更快被利用。
工业应用:主要氮源或辅助氮源;调节pH值生理酸性物质:代谢后能产生酸性残留物质。
(NH4)2SO4利用后,产生硫酸生理碱性物质:代谢后能产生碱性残留物质。
硝酸钠利用后,产生氢氧化钠。
3、无机盐和微量元素• 概念:组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质• 作用方式:低浓度起促进作用,高浓度起抑制作用。
• 种类:盐离子磷、硫、钾、钠、镁、钙,常常添加铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯,一般不加。
4、水菌体细胞的主要成分。
营养传递的介质。
良好导体,调节细胞生长环境温度。
培养基的主要成分之一。
5、生长因子(growth factor)概念:维持微生物生长所必需的微量有机物,不起碳源和氮源作用。
第27卷第4期深圳大学学报理工版V o l 127N o 142010年10月J OURNA L O F S HEN Z H E N UN I VER SITY SC I ENCE AND ENG I N EER INGO ct .2010文章编号:1000-2618(2010)04-0482-08=化学与化工>收稿日期:2010-06-22;修回日期:2010-09-06基金项目:国家高技术研究发展计划资助项目(2009AA063504);国家重点基础研究发展计划资助项目(2005c b221308)作者简介:夏文杰(1984-),男(汉族),湖北省咸宁市人,中国科学院博士研究生.E-m ai:l s j kr5201314@hot m ail 1co m 通讯作者:俞 理(1964-),男(汉族),中国石油勘探开发研究院高级工程师.E -ma i :l yu li3058@1631co m鼠李糖脂发酵条件优化和采油应用研究夏文杰,董汉平,俞 理(中国科学院渗流流体力学研究所,河北廊坊065007)摘 要:铜绿假单胞菌W J -1是从内蒙古自治区蒙古林油藏地层水中经筛选和驯化得到的一株兼性厌氧高产生物表面活性剂的烃降解菌株.经薄层层析、高效液相色谱及红外光谱分析,发现该菌株发酵的表面活性剂主要为鼠李糖脂(rha m nolipid ,RL).运用单因素实验和正交实验对菌株W J -1合成RL 的发酵条件进行优化,获得最佳培养基,碳源为葵籽油80g /L,氮源为N a NO 310g /L 、K 2H PO 42g /L 、CaC l 20112g /L 、M gSO 40124g /L 、FeSO 40112g /L 、N a 2M o O 40108g /L 和酵母膏112g /L.菌体生长最适pH 为710,最适温度为37e ;RL 合成最适p H 为715,最适温度为34e ,最适发酵时间为90~100h.在最优条件下使用3T 智能发酵罐发酵,RL 的产量达到5511g /L .RL 粗品能将水表面张力从72114mN /m 降至25101mN /m,临界胶束浓度为22m g /L .物理模拟驱油试验表明,铜绿假单胞菌W J -1产出的RL 在微生物采油上将有良好应用前景.关键词:微生物采油;铜绿假单胞菌;生物表面活性剂;鼠李糖脂;驱油;物理模拟中图分类号:Q 939197;Q 935;TE 357 文献标识码:A 鼠李糖脂(rha m no lipi d ,RL)是目前研究较多的一种生物表面活性剂,具有乳化、增溶和降低界面张力等功能,且低毒、易生物降解,在石油化工、生物医药、食品卫生及环境保护等领域有良好应用前景[1].多种铜绿假单胞菌(P seudo m onasaerug ino sa)都可利用不同碳源合成RL.RL 的制备主要通过微生物发酵,再从发酵液中提取得到,生产RL 的菌种以铜绿假单胞菌最为常用[2].目前,国内经微生物发酵得到的RL 产量较低,分离提取工艺复杂,且成本偏高,限制了RL 的规模化生产及应用,如大庆沃太斯化工有限公司[3]在专利中公开的发酵液中RL 的质量浓度为34~45g /L .因此,提高发酵液中的RL 产量,降低提取成本,对RL 的推广应用有重要意义.本研究通过对油藏地层水的筛选和驯化得到一株产RL 的优良菌种,运用单因素实验和正交实验对培养基组分及发酵条件进行优化,探讨了RL 的生长规律.对该菌种进行了16Sr DNA 鉴定,提取RL 进行成分鉴定和理化性质分析.通过优化发酵条件,RL 的产量可达55g /L 以上.物理模拟驱油效果评价实验表明,菌株W J -1合成的RL 在微生物采油上有很好的应用前景.1 材料与方法111 菌种分离用内蒙古自治区蒙古林油藏地层水(地层水成分单位为m g /L :N a +/K +226011,M g 2+11176,Ca2+67171,C l -3398128,SO 42-221188,AC-7104,属N a H CO 3水型)配制100mL 分离培养基,振荡培养(37e ,200r/m i n )5d 后,取011mL 均匀涂布于蓝色凝胶培养基上,常采用蓝色凝胶培养基筛选表面活性剂菌株,其配方为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB )5g /L 、次甲基蓝0102g /L 、营养琼脂20g /L 和去离子水1L ,在37e 恒温下培养2d .挑取周围产生蓝色菌圈的目标菌株[4],分离纯化得到一株产生最大深蓝色菌圈的菌株,命名为W J -1,于-80e 甘油管保存.http ://第4期夏文杰,等:鼠李糖脂发酵条件优化和采油应用研究483112培养基配方和培养条件种子培养基:蔗糖5g/L、牛肉蛋白胨015 g/L、酵母膏012g/L、N aC l012g/L,p H值为710 ~715.发酵培养基:豆油60g/L、N a NO36g/L、酵母膏115g/L、K2H PO43g/L、CaC l20101g/L、M gSO40102g/L、FeSO40101g/L、N a2M oO40101 g/L,p H值为710~715.摇瓶发酵条件:250m L三角瓶装100m L种子培养基,接种后置于摇床上培养36h(200r/m in, 37e)得种子液.250mL三角瓶装90mL发酵培养基,灭菌后接入10mL种子液,200r/m in,37 e培养100h.113菌株鉴定将甘油保种的菌株W J-1划线接种到LB琼脂(质量分数为118%)平板上,37e静置培养48h,挑取单菌落涂于载玻片并固定化,在OPTON AXI O-VERT35型光学显微镜和电子透射显微镜下观察细胞个体形态,并测量菌体大小.细菌的生理生化等鉴定参照文献[5].用DNA快速提取试剂盒(大连宝生物公司)提取菌株W J-1总DNA,采用细菌通用引物(27F, 5c-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3c;1541R,5c-AA-GGAGGTGATCC AGCC-3c)PCR扩增W J-1菌株16S r DNA,反应体系50L L.将PCR产物连接转化后送大连宝生物公司测序,具体方法见文献[6].测得的16S r DNA序列后在GenBank比对,对获得的同源序列进行分析,应用C l u ster X210软件进行多序列比对,采用M ega410软件中的neighbor-j o ini n g 法构建进化树.114表面活性剂提取及定性分析表面活性剂提取方法见文献[7],所得表面活性剂粗品用乙酸乙酯溶解,收集有机相,40e下旋转蒸发仪中蒸干溶剂得表面活性剂纯品,进行薄层层析(th i n layer chro m atog raphy,TLC)[8]、高效液相色谱(h igh perfo r m ance li q u i d chro m atography,H PLC)糖组分分析和红外光谱(i n frared spectra,I R)分析[9-10].115发酵指标测定取100mL发酵液于10000r/m i n离心得到菌体,置于100e恒温烘箱烘干至恒重,称重测定发酵液的生物量;采用Po w ereach J K99C型自动表面张力仪检测发酵液表面张力[9];RL糖脂含量测定采用蒽酮-硫酸比色法,具体方法见文献[7, 11].116发酵条件优化[4,12-14]11611单因素实验用B iolog细菌自动鉴定仪鉴定菌株W J-1的碳源利用范围,培养100h后测RL含量,具体方法见文献[12].采用发酵培养基,根据发酵条件对碳氮源的种类和数量、RL的最适合成温度、菌体生长最适温度及最适初始p H进行优化,平行实验3次取平均值.11612正交实验M g2+、Fe2+和C a2+是微生物生命活动中不可缺少的物质,酵母膏中含有生长因子能促进菌体生长和繁殖,钼酸钠对RL的合成具有促进作用,磷酸盐是菌体生长及物质合成的基础.以上6种因素还有相互协同作用,正交实验因素和水平选择如表1,平行实验3次.表1正交实验因素水平表T ab le1Factors and leve ls of th e orthogoha l tab le单位:%水平AM gSO4BF eSO4CK2HPO4DCaC l2EN a2M o O4F酵母膏10.0100.0050.0500.0050.0050.02020.0160.0080.1000.0080.0080.05030.0200.0100.2000.0100.0100.10040.0240.0120.3000.0120.0120.12050.0300.0150.5000.0150.0150.150 117物模实验驱油效果评价使用4根直径为215c m,管长为20c m的岩心,4#设为对照岩心.将石英砂模拟地层状况(原始油藏温度37e,空气渗透率67513@10-3L m2,孔隙度2417%,平均地面原油相对密度为019012 g/c m3;平均地层原油黏度为17911mPa#s;地层水总矿化度在1301m g/L)按比例(140~160目与325目的比例为6B1)混合均匀,人工压制、填实,用N2测气相渗透率.用蒙古林油藏地层水和油,确定孔隙体积V P、孔隙度、绝对渗透率及原始含油饱和度,具体方法见文献[15-16].将W J-1发酵液(体积分数为016%)、0106%聚合物(聚丙烯酰胺,质量浓度016g/L,相对分子质量215@ 107,新疆维油股份)和驱油剂(由体积分数为484 深圳大学学报理工版第27卷016%的发酵液和体积分数为0106%的聚合物组成)分别注入012V P 到1#、2#和3#岩心,恒温箱中静置7d .用地层水后续水驱,测定微生物提高采收率=(样品2次水驱-样品1次水驱)-(空白2次水驱-空白1次水驱).2 结果与讨论211 菌株W J -1鉴定结果菌株W J -1为短杆状,大小为110~115L m @118~214L m.革兰氏染色阴性、无芽孢(图1)、有鞭毛(图2),胞内有异染粒、无类脂颗粒.PC R 扩增得到菌株W J -1的16S r DNA 片段,测序长度1613bp ,通过GenBank 数据库中B last 比对,用邻位相连法构建系统进化树(图3),发现菌株W J -1与P seudo m onas aerug inosa 菌株的最高同源性达9910%(登记号FJ948174).该菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,保藏编号CG M CC N o .4002.图1 菌株W J -1芽孢染色F i g 11 Endospore stain i ng of stra i n W J-1图2 菌株W J -1透射电镜照片(@15000)F i g 12 Ce llm orphology of strai n W J -1undertrans -electron m icroscop e (@15000)图3 P seudo m onas aerugi nosa .W J -1菌株进化树Fig 13 Phylogen etic tree of Pseudo m onas aeruginosa.W J -1212 生物表面活性剂定性结果发酵液提取物经TLC 展开后用蒽酮-硫酸试剂显色,在R f =0162(展开剂为三氯甲烷、甲醇、水和冰乙酸,体积比为90B 8B 1B 1)处,样品与标准RL (美国,标准品质量分数\99%)均有棕黄色斑点,初步判断W J -1菌株产生的表面活性剂含RL 成分(图4);水解(用6m o l/L HCL 调节p H =210,封口于120e 下水解4h)后与鼠李糖、甘露糖、乳糖及葡萄糖标准品做H PLC 分析,结果表明水解后糖部分为鼠李糖.FT-I R 图谱(图5)分析表明,2954c m -1、2925c m -1、2855c m -1和1464c m -1是亲油的碳氢链中C ―H 伸缩振动所致,表明分子中存在―CH 2―;1054c m -1和3370c m -1处的宽吸收峰为糖―OH 伸缩振动所致;1736c m -1及1601c m -1是典型的与饱和脂肪链相连接的C O伸缩振动峰;1459c m -1和1378c m -1是由C ―H 或O ―H 变形振动引起;1283c m -1处宽峰是典型的酯吸收峰,进一步确定该生物表面活性剂为RL .图4 表面活性剂薄层层析F i g 14 Th in -l ayer chro matography ofthe crude b ios u rfactant213 碳源对RL 合成的影响B iolog 分析结果表明,菌株W J -1可利用液体石蜡、十六烷、蔗糖、葡萄糖和植物油等碳源合成RL .在其他条件不变情况下,利用不同碳源进行发酵,结果如图6,表明W J -1以液蜡为碳源时生长缓慢,菌浓度低,RL 产量低;以葡萄糖和蔗糖等单、http ://第4期夏文杰,等:鼠李糖脂发酵条件优化和采油应用研究485图5 表面活性剂红外光谱图F i g 15 Th e infrared spectrum of the crude biosurfactant双、多糖为碳源时菌浓高但RL 产量不高;以植物油为碳源时菌浓度高,RL 产量高,含量为20~42g /L ,其中以葵籽油为碳源时RL 产量最高.以葵籽油为碳源,其他成分及发酵条件不变,考察在不同浓度梯度下碳源的量对RL 合成的影响(图7).结果表明,在一定范围内随葵籽油含量增加,RL 产率(RL 含量与碳源量之比)增加;葵籽油质量浓度高于80g /L 时,RL 产率下降.可见葵籽油在达到一定含量后对RL 合成有抑制作用,投加量越多抑制作用越明显.因此为提高RL 合成并降低发酵成本,发酵碳源葵籽油投加量以80g /L 为宜.图6 碳源种类对细胞生长和RL 合成的影响F ig 16 E ffect of d ifferen t carbon source on ce ll gro w thand rha m nolipid yie l d214 氮源对RL 合成的影响图8表明几种有机和无机氮源对菌株W J -1合成RL 的影响.从中可知,不同的氮源相应RL 产量及菌体浓度差别大,以硝酸钠和尿素为氮源时,RL 产量均较高;以氨基氮为氮源时,产量相对低;使用有机氮源时,W J -1在培养初期生长速度较快,图7 碳源数量对细胞生长和RL 合成的影响F i g 17 E ffec t of carbon s ource quan tity on cell gro w th and rha m noli p i d y iel d菌浓度相对较高,但发酵液中RL 含量较低.考虑到氧化还原电位对铜绿假单胞菌生长及生化活性的影响,选择硝酸钠为最佳氮源.图8 氮源对细胞生长和RL 合成的影响Fig 18 E ffect of n itrogen source on ce ll gro w thand rha m nolip i d y i e l d图9 碳氮比对细胞生长和RL 合成的影响F ig 19 E ffect of the rati o between carbon and n itrogensource on cell grow th and rha m nolip i d yie l d215 碳氮比对RL 合成和菌体成长的影响以葵籽油为碳源,硝酸钠为氮源,其他组分不变,得出不同碳氮源质量比m (C )B m (N )对RL 产量的影响,结果如图9,表明在m (C)B m (N)为8B 1时RL 产量最高;m (C )B m (N)低于4B 1时,菌体浓度最大.因此,铜绿假单胞菌W J -1发酵采用分批补料发酵,控制发酵过程各阶段的m (C)B m (N )比http ://486深圳大学学报理工版第27卷值,从而使菌体生长和产物合成都能达到最佳状态.216多因素的正交优化实验用正交设计助手II V311软件,进一步分析M g-SO4、FeSO4、K2H PO4、CaC l2、N a2M oO4及酵母膏对W J-1菌株合成RL的影响.L25(56)正交实验结果见表2,由表可知,N a2M o O4为显著因素,极差大小主次顺序为E>D>F>B>C>A,较好的因素水平搭配是A4B4C1D2E5F5.方差分析结果表明, Na2M o O4为显著因素,与极差分析结果类似,见表3.因此最优培养基配方为:碳源为葵籽油80g/L、氮源为N a NO310g/L、K2H P O42g/L、CaC l20112g/L、M gSO40124g/L、FeSO40112g/L、N a2M o O40108 g/L、酵母膏112g/L.表2正交实验结果分析T ab le2V isual analysis of orthogonal exper i m en ts均值A B C D E F128.36830.26031.62230.59628.40429.494 229.55830.92229.25432.52226.25227.848 330.78430.35430.34226.37826.80228.890 431.37032.10228.26032.22630.88431.034 530.55426.99631.15628.91238.29233.160极差3.0025.1063.3626.14412.0405.312表3正交实验结果的方差分析Tab le3Var i an ce ana l ysis of orthogon al experi m ents因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性A7.11840.16214.280B2.90240.4354.714C17.12640.22231.354D2.39640.7785.462E32.74242.87663.234显著F25.85641.52753.349217温度和pH值对RL合成的影响由图10可知,在pH值为6~9范围内,RL产量均较高,710为菌体生长最适初始pH值,715为RL最适合成初始p H值.不同温度梯度实验结果如图11,表明较低的发酵温度不利于RL合成及菌体生长,菌体生长最适温度为37e,而RL合成最适温度为34e.图10初始pH对菌体生长和RL合成的影响F i g110E ffect of i n itial pH on ce ll grow th andrha mnoli p idyield图11温度对菌体生长和RL合成的影响F i g111E ffect of te m perature on ce ll grow th andrha mnoli p id yield218RL发酵的扩大结果在最优条件下采用3级发酵,前2级为种子培养阶段,发酵主体是3T的智能发酵罐.1级种子培养阶段,培养10h后按10%接入量接入2级种子罐;2级种子培养阶段,培养10h后以10%接入发酵罐.1级种子数为213@107CF U/mL;2级种子数为619@108CFU/mL.根据RL合成时间[6],菌体先进入稳定期,之后RL大量合成,因此,前10 h为菌体生长阶段,设置培养条件为37e,p H= 710,m(C)B m(N)=4B1;10h后为RL合成期,设置条件为34e,pH=715,通过流加发酵方式向发酵罐体补充碳源使m(C)B m(N)=8B1(按比例配好后加入).发酵过程中,由于RL合成形成大量泡沫,通过调节转速和添加消泡剂(聚醚)消泡,以免泡沫顶罐染菌.发酵结果见图12.在发酵初期, RL产量很低;在菌体进入对数生长后期(约14h)时,RL质量浓度增加,菌体生长进入稳定期;到第4期夏文杰,等:鼠李糖脂发酵条件优化和采油应用研究48780h 时菌体浓度达到顶峰,RL 质量浓度仍在增长;至96h 时RL 质量浓度达到顶峰,约5511g /L ;96h 后RL 质量浓度开始下降.可见RL 最佳合成期为90~100h.图12 RL 合成与菌体的生长曲线F i g 112 Rha m nolip i d produc ti on and grow th curve of strai n219 表面活性剂C MC将RL 粗品配制成不同质量浓度溶液,于20e ,常压下测其溶液表面张力.结果见图13,随RL 质量浓度增加,表面张力减小,当质量浓度增至一定值时,表面张力不再有显著变化.水表面张力从72114mN /m 降至25101mN /m,图中曲线的切线交点处为表观C MC (01022g/L).图13 临界胶束浓度的测定Fig 113 Deter m i nation of th e criticalm i ce lle concen tration2110 物理模拟效果评价实验物理模拟实验结果分析表明:在其他条件相同时,1#岩心驱油效率为6156%,2#岩心驱油效率为9108%,3#岩心驱油效率为23108%.与聚合物驱相比发现,RL 与聚合物复配体系大幅度提高了原油采收率,加入RL 具有促进作用.聚合物增黏调堵大孔道,增加水相黏度,减少油水流度比,调整油水剖面,增大波及面积和波及系数,利于小孔道/孔隙原油的驱替;表面活性剂降低界面张力,乳化剥离原油,两者共同作用,大幅度提高原油采收率.相关参数及结果见表3.表3 物理模拟参数Tab l e 3 Th e para m e ters of th e test i ng cores编号尺寸/(c m @c m )孔隙体积V P /mL 孔隙度/%渗透率/L m 2原始含水饱和度/%原始饱和油/mL 一次水驱/%后续水驱/%1#岩心2.5@2036.0836.770.44612.5630.4549.9257.792#岩心2.5@2035.8836.570.36912.3631.4048.3358.743#岩心2.5@2034.9935.660.44913.2630.3562.9387.324#空白2.5@2035.2436.420.42913.0830.5660.1261.43结 语本研究报道了一株分离自内蒙古自治区蒙古林油藏地层水的高产表面活性剂的降解菌株,经形态观察、生理生化实验和16S r DNA 基因序列分析,鉴定为铜绿假单胞菌P seudo m ona s aerug inosa.通过TLC 、H PLC 和I R 分析,该表面活性剂为RL .单因素和正交实验确定了菌株W J -1高产RL 的最优化培养基和发酵条件,研究了W J -1在最优条件下合成RL 的发酵动力学,表明铜绿假单胞菌W J -1在最优发酵条件下RL 产量为5511g /L,比国内2008年5月专利中公布的RL 产量高出10g /L 以上[3].分析了该菌株所合成的RL 得物理化学性质,表明该RL 产品具有很高的表面活性.驱油物理模拟实验表明,该RL 在微生物采油上具有很好的应用前景.参考文献:[1]R e i s R S ,Ro cha S L G,Chapeaurouge D A,等.碳氮源在铜绿假单胞菌PA 1合成鼠李糖脂中对蛋白组的影响研究[J].生化工程,2010,32(5):925-930.(英文版)http ://488深圳大学学报理工版第27卷[2]孙月娥,王卫东.脂肪酸糖酯类表面活性剂的合成及应用[J].化学通报,2010,73(4):302-307.[3]大庆沃太斯化工有限公司.一种鼠李糖脂生物发酵液的工业化制备方法:中国,C N101177696A[P].2008-05.[4]叶和松,盛下放,江春玉,等.生物表面活性剂产生菌的筛选及其对土壤重金属铅的活化作用[J].环境科学学报,2006,26(10):1631-1636.[5]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:128-194,365-398.[6]郑承纲,俞理,吴庆红,等.一株短降解菌Rhodo-coccus ruber Z25研究[J].深圳大学学报理工版,2009,26(3):234-240.[7]卢国满,刘红玉,曾光明,等.鼠李糖脂快速定量分析方法及其影响因素研究[J].微生物学通报,2006,33(4):106-111.[8]盖立学,宋考平.基于糖显色法测定鼠李糖脂的比例、含量[J].生物技术,2010,20(2):33-37.[9]Das K,M ukherjee A K.应用廉价碳源比较芽孢杆菌的液相和固相发酵脂肽类表面活性剂:表面活性剂工业应用[J].生物化学进展,2007,42(8):1191-1199.(英文版)[10]王靖,陈云.生物表面活性剂及其评价方法[J].化学研究与应用,2009,21(2):673-679. 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Physica l si m u lati o n experi m ents sho w tha t rha m no lipid synthesized by P seud o m onas aerugino s a W J-1has a pr o m ising prospect i n m icr obia l enhanced oil recovery(M EOR)technology.K ey words:m icr obia l enhanced o il recovery(MEOR);P seudo m onas aerug inosa;b i o-surfactan;t rha m no li p i d; o il d isp l a ce m en;t physical si m ulationTh i s w ork w as supported by the Nati onalH i gh T echnology Research and Devel op m en t Progra m ofC h i na(2009AA063504)and t h eM aj or S tate Basic Res earch Devel opm en t Progra m of Ch i na(2005cb221308).R eferences:[1]R e i s R S,R ocha S L G,Chapeaurouge D A,e t a.lE ffec ts o f ca rbon and n itrog en sources on the proteome o fPseudo m onas aerug i no sa PA1dur i ng rha mno lipi d produc-tion[J].P ro cess B i ochem istry,2010,32(5):915-929.[2]SUN Yue-e;W ANG W e-i dong.Syntheses and applica ti onsof carbohydrate fa tty ac i d esters[J].Che m istry,2010,73(4):302-307.(i n Ch i nese)[3]D aq i ng W o taisi Che m i ca ls Co.L td.Industr i a l preparati onm ethod o f rha m no li pids fe r mentation-bro th:China,CN101177696A[P].2008-05.(in Chi nese)[4]YE H e-song,S HENG X i a-fang,JI ANG Chun-yu,e t a.lT he iso l a ti on o f biosurfactant-produc i ng bac teria and theire ffect on the ava ilab ilit y of lead i n so il[J].A cta Scien tiaeC ircum stanti ae,2006,26(10):1631-1636.(i n Ch-inese)[5]DONG X i u-zhu,CA I M i ao-y i ng.M anua l o f Syste m atic I-dentifi cation o f Common Bacteria[M].Be iji ng:Science P ress,2001:128-194,365-398.(i n Ch i nese)[6]ZHENG Cheng-gang,YU L,i W U Q i ng-hong,e t a.lRhodococcus ruber Z25,ahydro ca rbon-degrada ting stra i n[J].Journa l o f Shenz hen U niversity Sc i ence and Eng-ineer i ng,2009,26(3):234-240.(i n Ch i nese)[7]LU G uo-m an,L I U H ong-yu,ZE NG Guang-m i ng,et a.lSt udy on rap i d m ethods for quantitati ve analysis rhamno li p i d and its i nfl uence factors[J].M icrob i o logy.2006.33(4).106-111.(in Ch i nese)[8]GA I L-i xue,SONG K ao-pi ng.R a tio and content of rham-no li p i d deter m i ned usi ng sugar deve l op m ent process[J].B i o techno l ogy.2010,20(02):33-37.(in Ch i nese)[9]D as K,M ukher j ee A par i son of li popeptide biosur-factants producti on by Bacillu s sub tilis strains i n sub m erged and so lid sta te f e r m enta tion syste m s usi ng a cheap ca rbonsource:som e industr i a l appli cations of b i osur f ac tants[J].P rocess B i o che m i stry,2007,42(8):1191-1199.[10]WANG Ji ng;CHEN Y un.Categor i es and eva l uati ngm e t hods of b i osurfac tants[J].Che m ica l R esearch andAppli ca tion,2009,21(2):188-192.(i n Ch i nese)[11]WU Jane-y i,i YE H K ue-i li ng,LU W e-i bi n,et a.l R h-a m no lipid producti on w ith i nd i genous P seudom onasaerug inosa E M1i so lated fro m o i-l contam ina ted site[J].B i o resource T echno l ogy.2008,99(5):1157-1164.[12]HUANG H a-i dong,W ANG W e,i M a T i ng,e t a.l O pt-im izati on of culture cond iti on for novel biopo l ym er Ss pro-ducti on by Sp hingom ona s sp.Stra i n TP-3[J].M icrob i o l o-gy.2009.36(2).155-159.(i n Ch i nese)[13]R aza Z A,R eh m an A,K han M S,et a.l I mprov ed pro-duc ti on o f biosurfactant by a P seudom onas aerug inosa m u-tant us i ng vege tab l e o il re finery w astes[J].B i odeg rada-ti on,2006,18(1):115-121.[14]Thanom sub B,Pu m eechockchaiW,L i m trakul A,et a.lChe m i ca l structures and b i o l og ical activ ities o f rhamnoli p i dproduced by P seudom onas aerug inosa B189iso l a ted fromm ilk factory w aste[J].B i o resource T echno l ogy,2007,98(5):1149-1153.[15]S HEN P ing-p i ng,C H E N X i ng-l ong,Q I N J-i shun.Pres-sure character i stics i n CO2flood i ng exper i m ents[J].Pe-tro leu m Explorati on and D eve l op m ent,2010,37(2):211-215.(in Chi nese)[16]ZHENG X iao-m i n,S UN Le,i W ANG L e,i et a.l Phy s-ical si m ulation o f w ater d ispe lli ng o ilm echan i s m for vuggyfractured carbona te ro ck reservo ir[J].Journal of South-w est P etro l eu m U n i versity Sc i ence and T echno l ogy Edition,2010,32(2):89-93.(i n Chi nese)=中文责编:晨兮;英文责编:艾琳> 。
微生物油脂开发及研究摘要:微生物油脂是一种应用前景广阔的新型油脂资源,正越来越受到人们的重视,该文对产油微生物常见种类、产油机理、微生物油脂的特点及产油微生物的必备条件,微生物油脂的开发应用现状等方面进行了综述,展望了其研究的发展前景。
关键词:微生物油脂;开发应用现状;生物柴油;研究发展前景1 引言微生物油脂(microbial oils)又称单细胞油脂(single cell oil,SCO),是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源,在菌体内产生的大量油脂。
微生物油脂主要是由不饱和脂肪酸(PUFAs) 组成的甘油三酯(TAG) ,在脂肪酸组成上与植物油如菜籽油、棕榈油、大豆油等相似,是以C16和C 18为主的脂肪酸。
在一定的条件下,很多微生物如细菌、霉菌、酵母菌及藻类等可在菌体内产生大量油脂,有的干菌体含油量高达60%以上。
微生物油脂的研究和开发,不仅丰富了传统的油脂工业技术,而且是工业化生产油脂的一个重要途径。
尤其在目前人口增长使得油脂需求量与自然资源严重短缺的矛盾日益尖锐的情况下,开辟新油源—微生物油脂更具有重要的理论和实际意义[1]。
1.1 产油微生物种类能够生产油脂的微生物有酵母、霉菌、细菌和藻类等,其中真核的酵母、霉菌和藻类能合成与植物油组成相似的甘油三酯,而原核的细菌则合成特殊的脂类。
目前研究得较多的是酵母、藻类和霉菌。
现在用于生产多不饱和脂肪酸的微生物主要为藻类、细菌和真菌,由于细菌产量低,所以目前主要集中在藻类和真菌[2]。
1.2 微生物产生油脂机理微生物产生油脂过程,本质上与动植物产生油脂过程相似,都是从利用乙酰COA羧化酶的羧化催化反应开始,经过多次链的延长,或再经去饱和酶的一系列去饱和作用等,完成整个生化过程。
其中去饱和酶是微生物通过氧化去饱和途径、生成不饱和脂肪酸的关键酶,该过程称之为脂肪酸氧化循环。
Kendrack等发现苹果酸能促进卷枝毛霉(Mucor circinelloide s)微粒体的去饱和作用,使GLA含量增高,这可能是苹果酸酶为去饱和作用而提供NADPH结果。
醋酸菌培养条件的优化及醋酸分批发酵来源:生物化学资料网摘要:目的醋酸菌培养条件的优化与醋酸发酵实验。
方法通过正交试验确定最佳培养条件,并在优化条件下进行分批发酵。
结果优化培养条件为:葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,乙醇10%(v/v),pH 5.5,装量50 mL/500 mL,静置培养5 d。
在优化条件下,醋酸产量比用普通产酸培养基提高了36.4%。
应用于分批发酵试验产酸较高。
结论优化培养条件适合醋酸菌生长与醋酸发酵。
关键词:醋杆菌属巴氏醋杆菌;培养条件;正交设计;分批发酵山西老陈醋不仅是具有“绵、酸、香、甜、鲜”独特风味的调味品,还因其富含多种氨基酸、维生素和微量元素而作为保健品得到广泛使用。
近年山西醋业发展迅猛,生产规模日渐扩大,生产技术日新月异,促进了山西老陈醋的发展。
在食醋生产中,菌种起着至关重要的作用。
一株优良的生产菌株能起到提高产量、稳定质量的目的。
本实验室从醋醅中分离到一株醋杆菌属巴氏醋杆菌S12,经N+离子注入诱变获得高产突变株SM12-87。
对其培养条件进行了优化设计,得出了最佳培养条件。
在正交试验对醋酸菌发酵条件掌握的基础上,通过液态分批发酵对优化后的培养条件进行检验。
在67 h生产出92.8 g/L的醋酸,乙醇转酸率达到90.08%,极大地缩短了生产周期,减少了成本。
1仪器与材料1.1材料山西老陈醋醋醅(由山西老陈醋集团有限公司提供);醋杆菌属巴氏醋杆菌(Acetobacter past-eurianus)SM12-87(本实验室保存)。
1.2主要设备仪器全自动式 5 L发酵罐(Edison.N.J.,USA);GC9800型气相色谱仪(上海科创公司);HQL150B型恒温摇床(中科院武汉科学仪器厂)。
1.3培养基1.3.1产酸培养基葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,pH 5.5,分装于500 mL三角瓶,每瓶100 mL,121 ℃灭菌20 min,使用前加入7%(v/v)无水乙醇。
课堂报告名称:高产微生物油脂菌株培养基及发酵条件优化方法一、课堂报告依据的知识背景1. 培养基及其分类人类想要研究利用微生物,就必须先培养微生物。
培养微生物要有适合微生物生长繁殖的环境条件,还要适宜的营养条件。
由人工配置的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质,称作培养基。
◆按用途分类:增殖培养基;选择培养基;鉴别培养基。
◆按状态分类:液体培养基;固体培养基;半固体培养基。
◆按化学成分分类:天然培养基;合成培养基;半合成培养基。
◆按目的分类:种子培养基;发酵培养基。
1). 培养基包含成分a)水:水分是微生物重要组成部分,微生物不能脱离水而生存,微生物所需的营养也只有溶于水才能很好地吸收,水利于调节细胞温度,保持细胞生活环境的温度恒定。
水分为两种状态,自由水和结合水。
前者以游离态存在,是细胞内的溶剂;后者与细胞内其他成分结合,不易蒸发,不冻结,不渗透,也不能作为溶剂。
b)碳源:提供为生物细胞组成和代谢产物中碳素来源的物质。
提供微生物生长繁殖所需的能量。
碳源分类很多,无机碳化合物有二氧化碳、碳酸盐等;有机含碳化合物,如糖类、醇类、有机酸、蛋白质及其分解产物。
c)氮源:可提供为生物细胞组成和代谢产物中氮素来源的物质。
氮源用来合成氨基酸和碱基进而合成蛋白质、核酸等细胞成分以及含氮代谢产物。
氮源分类:1.分子态氮,存在大气中,仅有少数微生物可以利用;2.无机态氮,如铵盐、硝酸盐等,多数微生物可以利用;3.有机态氮,蛋白质及各种分解产物、尿素、嘌呤碱、嘧啶碱等。
d)能源:提供微生物生命活动过程中所需的能量来源的物质。
异养微生物能源为碳源;自养微生物能源是日光。
e)生长因子:微生物不能自行合成,但生命活动又不可缺少的微量有机营养物质。
功能:构成细胞的组成成分,如嘌呤、嘧啶是核酸的组成成分;调节代谢,维持正常的生命活动。
自养微生物不需要生长因子,能自行合成;异养微生物有三种情况:有些异养微生物需要生长因子,如谷氨酸的短杆菌,需要添加生物素才能使菌体生长良好;有些不需要生长因子;有些不但不需要还能在自身积累某些维生素,如肠道微生物分泌大量维生素供机体吸收利用,大肠杆菌合成维生素K。
f)无机盐类:微生物生长过程中不可缺少的营养物质。
从量的角度分主要元素和微量元素两大类。
前者指磷钠硫钙镁铁等;后者锌锰钼钴等。
作用:构成细胞组成成分,磷是核酸的组成元素之一;做酶的组成成分或酶的激活剂,铁是过氧化氢酶细胞色素氧化酶的组成成分,钙是蛋白酶激活剂;调节微生物的生长的物理条件,渗透压、氢离子浓度、氧化还原电位等;作为某些自养微生物的能源,如硫细菌以硫作为能源。
g)碳氮比:是指有机物中碳的总含量与氮的总含量的比,适当的碳氮比例,有助于微生物发酵分解。
碳氮比过高和过低都不利于细胞生长和外源蛋白表达和积累,过低导致菌体提早自溶;过高导致细菌代谢不平衡,最终不利于产物的积累。
即使碳氮比处在合适水平,碳源和氮源浓度过高和过低也不利于细胞生长和外源蛋白表达和积累,浓度过高,细胞在发酵过程后期生长缓慢,代谢废物产生较多,最终使得菌体代谢异常,影响外源蛋白合成;浓度过低,培养基所能提供的营养物质有限,影响细胞的繁殖。
因此培养基除了氮源碳源浓度适宜,还需要二者比例关系确定。
h)PH值:各类微生物生长的PH值不尽相同,环境中的pH值对微生物的生命活动影响很大,主要作用在于:引起细胞膜电荷的变化,从而影响了微生物对营养物质的吸收;影响代谢过程中酶的活性;改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性。
每种微生物都有其最适pH值和一定的pH范围。
在最适范围内酶活性最高,如果其他条件适合,微生物的生长速率也最高。
大多数细菌、藻类和原生动物的最适pH为6.5-7.5,在pH 4-10之间也可以生长;放线菌一般在微碱性即pH7.5-8最适合;酵母菌、霉菌则适合于pH5-6的酸性环境,但生存范围在pH1.5-10之间。
有些细菌甚至可在强酸性或强碱性环境中生活。
i)渗透压:恰好能够阻止水分子通过半透膜从浓度较低的溶液移向浓度较高的溶液的在较高浓度溶液的液面上施加的额外压强称为渗透压。
培养基内物质浓度要合适。
j)氧化还原电位:一般,好氧微生物在氧化还原电位为正时都能生长,而厌氧微生物要求氧化还原电位为负值,其中严格厌氧微生物要求氧化还原电位在-400mV以下2).培养基配制的基本原则a.要确定研究目的,明确微生物的营养类型,同时应该了解微生物的类群、生活环境;b.应当查阅大量文献,总结借鉴前人工作经验;c.具体问题具体分析,本着既要满足微生物的生长繁殖或积累大量代谢产物d.要求,同时又要降低成本的原则,通常从培养基成分考虑,以配制生长繁殖所需的培养基。
二、撰写课堂报告的目的1.了解微生物营养与生长的相关知识;2.了解培养基成分、类型;3.熟悉高产油脂微生物的种类;4.学会用培养基培养筛选需要的菌株;5.学会优化培养基发酵条件。
三、撰写课堂报告的思路通过对微生物营养与生长相关知识的学习掌握,围绕高产油脂菌株培养基优化与培养条件优化这一研究问题,通过对高产油脂菌株的特点进行分析,寻找培养基优化和培养条件优化最佳方法,初步构建高产油脂菌株的培养基与培养条件优化的方法体系。
四、课堂报告的正文1.产油脂微生物1)微生物油脂又称单细胞油脂,是酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定的条件下,以碳水化合物和普通油脂为碳源,在菌体内产生油脂。
2)常见产油微生物种类能生产油脂的微生物有酵母菌、霉菌、细菌和藻类等。
其中真核的酵母菌、霉菌和藻类等能够合成与植物油组成类似的甘油三酯,而原核的细菌则合成特殊的脂类。
目前研究的较多的是酵母菌、霉菌和藻类。
现在用生产多不饱和脂肪酸的为真菌、细菌和藻类,由于细菌产量低,目前主要集中在真菌和藻类。
微生物生产油脂不仅具有油脂含量高、生产周期短、不受季节影响、不占用耕地等优点;而且可用细胞融合、细胞诱变等方法,使微生物产生高营养油脂或某些特定脂肪酸组成油脂,如EPA、DHA、类可可脂等3)微生物油脂的产油机理微生物产乍油脂的过程本质上与动植物产生油脂的过程相似,都是从利用乙酰 CoA羧化酶的羧化催化反应开始,经过多次链的延长及经去饱和酶的一系列去饱和作用等,完成整个生化过程。
4)高产油脂菌株生物量与油脂测定方法(1)菌体生物量测定:湿菌体于60℃烘至恒重,以g干菌体,L发酵液表示菌体生物量。
(2)油脂测定方法:提油前菌体的处理采用酸热法破碎细胞,即在菌体中加入4mol/L的盐酸溶液沸水浴20min,使细胞破碎。
菌体油脂采用索氏抽提法,即用低沸点有机溶剂(乙醚或石油醚)回流抽提,除去样品中的粗脂肪,以样品与残渣重量之差,计算粗脂肪含量。
由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外,还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质,因而抽提法测定的结果只能是粗脂肪。
2.微生物油脂菌株培养1)高产油脂菌株的筛选用于生产微生物油脂的菌株要求具备以下条件:(1)具备或改良后具备合成油脂的能力,油脂积累量大,含油量稳定在50%以上且油脂转化率不低于15%。
(2)能利用农副产品及工业废水、废料。
(3)繁殖力旺盛,杂菌污染困难,沉淀、过滤、分离油脂容易。
(4)油脂风味良好,食用无害,易消化吸收。
(5)用于工业化生产时能适应工业化深层培养,装置简单。
此外菌种不同,培养条件不同,产品也不同。
一些菌株油脂的脂肪酸组成、类型及甘三酯组成2)菌株的选择脂肪粒计数法、苏丹三菌泥染色法、碳饥饿检出法3)菌株的制备①微生物油脂的生产工艺流程如下:菌种筛选一—原料——灭菌——菌体培养——菌体收集——预处理——油脂提取——精炼成品油脂。
②菌体的培养大量的试验证明,不同种属的微生物,其油脂含量、油脂成分各不相同。
即使同一种微生物在不同的培养条件下,其产油量和油脂成分也不尽相同。
与此相关的培养条件主要有碳源、氮源、温度、pH 值等。
碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖等;氮源有胺盐、尿素等。
微生物培养可采用液体培养法、固体培养法和深层培养法。
4)培养基包含的各成分对对菌体产油脂的影响a.碳源和氯源对菌体产油脂的影响碳源是微生物产油脂的一个关键因素,当培养基中碳源充足而其它营养成分缺乏时,微生物菌株会将过量的碳水化合物转化为脂类。
目前最常用的碳源是葡萄糖,因为以葡萄糖为碳源可获得更高的菌体生物量,而且其价格相对于其它碳源更便宜,有利于降低成本。
氮源的主要作用是促进细胞的生长,高C/N有利于菌体生长,低 C/N 有利于油脂的积累,此外氮源的种类也会影响油脂的积累。
b.培养时间对菌体产油脂的影响微生物细胞的油脂含量随微生物生长阶段的不同而有显著差异,如油脂酵母的油脂含量在生长对数期较少,在生长对数期末期开始急剧增加。
至稳定期初期达到最多。
培养时间的长短也是一个影响因素,培养时间不足,菌体总数少而影响油脂产量;培养时间过长,细胞变形、自溶,合成的油脂进入培养基中难以收集,同样影响油脂产量。
此外,不同微生物的最佳培养时间也不相同。
c.温度对菌体产油脂的影响温度的改变之所以能调节脂肪酸成分。
是由于细胞对外界温度的化会产生一种适应性反应。
通常情况下,不饱和脂肪酸的熔点比饱和脂肪酸低,短链脂肪酸的熔点比长链脂肪酸低。
因此当菌株从高温转移到低温时,细胞膜不饱和脂肪酸及短链脂肪酸含量增加,主要是棕桐油酸或油酸等含量的增加;当温度升高时,平均链长就增长,有利于细胞膜的正常流动和增强其通透性。
d.pH值对菌体产油脂的影响不同种类的微生物,产油的最适pH值也不同,霉菌的为中性至微碱性。
油脂酵母培养基的初始 pH值越接近中性,稳期菌体的油脂含量越高。
在培养过程中不断调整 pH值,使微生物处于其最适 pH值范围内。
可有效地提高微生物的产油量。
e.通气量对菌体产油脂的影响油脂是由基质的糖类还原而成,当微生物产生油脂时,必须供给大量氧气,不饱和脂肪酸的生物合成也需要大量氧气。
研究发现,产油真菌在供氧不足的条件下,甘油三酯的合成会强烈受阻,并引起磷脂和游离脂肪酸大量积累;在通气条件下。
游离脂肪酸会部分转化成含有2个或3个双键的脂肪酸,从而使不饱和脂肪酸大量增加。
f.无机盐对菌体产油脂的影响对真菌而言,适当增加无机盐和微量元素的添加量可提高油脂合成速度和产油量。
在培养基中适当增加 Na,K,Mg等元素含量。
日本长沼等人员研究证明,在培养基中适当增加Fe,Zn离子,可加速产油微生物对油脂的合成,但添加量不宜太大,否则会严重阻碍真菌对油脂的合成。
3. 发酵条件的优化方法1)培养基的优化通常包括以下几个步骤:①所有影响因子的确认;②影响因子的筛选,以确定各个因子的影响程度;③根据影响因子和优化的要求,选择优化策略;④实验结果的数学或统计分析,以确定其最佳条件;⑤最佳条件的验证。
5.)优化方法经以上几种方法的比较,我们可以通过把几种试验方法的结合,减少实验工作量,但又得到比较理想的结果。