同源型凝血活酶试剂检测重组人野生型和突变型凝血因子Ⅶ
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文章编号：１００７—４２８７（２００８）０４—０５４０—０２
Ｃｈｉｎ Ｊ Ｄｉｍ￣ｎ，Ａｏｒｉｌ，２００８，Ｖ０ｌ １２，Ｎｏ．４
同源型凝血活酶试剂检测重组人野生型
和突变型凝血因子Ⅶ
洪国舞 ，徐元斌 ，吴玉水
（１．福建医科大学附属第一医院检验科，福建福州３５００２５；２．南京军区福州总医院全军医学检验中心）
遗传性凝血因子ＶＩＩ（ｖＶｌＩ）缺乏症患者血浆中Ｆ
Ⅶ凝血活性降低，出现不同程度的出血倾向。早先
我们报道了遗传性ＦⅦ缺乏症２个家系患者的ＦⅦ
基因存在Ｃｙｓ３２９Ｇｌｙ错义突变［ ．２］。为了研究该突 变对ＦⅦ的功能影响，我们将野生型ＦⅦ和 Ｃｙｓ３２９Ｇｌｙ突变型真核表达载体转染ＢＨＫ一２１细胞进 行体外表达，并用自制同源型凝血酶原试剂［。Ｊ对表 达产物进行凝血活性的检测。 １材料与方法 １．１材料 野生型ＦⅦ真核表达载体ｐＣＤＮＡ３／ｔＴｗｔ为伦敦 帝国大学Ｊ０ｈｎ ＭｃＶｅｙ博士惠赠。质粒提取试剂盒 购自上海博亚生物工程公司。ＢＨＫ一２１细胞由第四 军医大学微生物学教研室提供。ＭＥＭ培养基和脂 质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品。胎牛血清 为ＧｉｂｃｏＢＲＬ产品。血浆标准品及乏ＦⅦ血浆为Ｓｔａ— ｇｏ产品。半自动凝血仪为Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ ＳＴ。液体 凝血活酶试剂为本中心制备。 １．２方法 １．２．１表达质粒的纯化构建Ｃｙｓ３２９Ｇｌｙ突变型Ｆ Ⅶ基因真核表达载体 Ｊ。按说明书提供的方法，用 质粒提取试剂盒（上海博亚生物工程公司）分别纯化 野生型ＦⅦ表达质粒、Ｃｙｓ３２９Ｇｌｙ突变型ＦⅦ表达质 粒和空载体质粒对照，定量后一２０％保存备用。 １．２．２ ｖＶｌＩ基因的瞬时转染与表达在直径３５ ｍｍ 的细胞培养板上接种ＢＨＫ一２１细胞１ Ｘ １０５个／孔， ３７％含ＣＯ２环境中培养过夜。按试剂说明书提供的 方法，２ ｌｌｇ质粒ＤＮＡ与５ ｌ脂质体混合作用４５ ｍｉｎ 后，每孑Ｌ转染５ ｈ（野生型ＦⅦ表达质粒、突变型ＦⅦ 表达质粒和空载体质粒对照，每一实验设三个复 孑Ｌ）。换ＭＥＭ完全培养基继续培养。分别于２４ ｈ 和４８ ｈ后收集细胞培养液用于凝血酶原时间（Ｐｒ） 测定。 ＊通讯作者 １．２．３表达产物的凝血活性检测用自制液体凝血 活酶试剂［３ ３进行ｆ，ｒ检测（磁珠凝固法）。 ２结果 在转染后培养４８ ｈ的细胞培养液和细胞裂解
液中，均检测出野生型ＦⅦ基因表达的蛋白产物的
凝血活性，但未能检测出突变型ＦⅦ基因表达的蛋
白产物的凝血活性（ＰＴ值大于空载体质粒对照孑Ｌ）
（见表１，结果为三个复孑Ｌ的平均值）。
表１体外表达的野生型和突变型ＦⅦ的凝血活性检测
３讨论
ＦⅦ以无活性的酶原形式存在于循环血中，血
管损伤后释放的组织因子（ｒＩ１Ｆ）可快速激活ＦⅦ，生
成活化的ＦＶＩＩ（ｖＶｌＩａ）。ｖＶｌＩａ与ｒＩ１Ｆ一起参与启动外
源性途径的凝血过程。国外的研究资料表明 ］，遗
传性ＦⅦ缺乏症的临床表现、血浆ＦⅦ凝血活性（Ｆ
Ⅶ：Ｃ）及ＦｖＩＩ抗原（ＦＶＩＩ：Ａｇ）￣ｔＪ定值三者之间无明显
相关性，其原因未明，故对遗传性ＦＶＩＩ缺乏症进行
基因型分析十分必要。除了我们报道的遗传性ＦⅦ
缺乏症２个家系患者的ＦⅦ基因存在Ｃｙｓ３２９Ｇｌｙ错
义突变外［ ＇２］，后来台湾和香港的学者也报道了３
个家系存在的Ｃｙｓ３２９Ｇｌｙ杂合子突变，但均未进行该
突变型ＦＶＩＩ的体外表达和功能鉴定。已知Ｃｖｓ一３１０
与Ｃｙｓ一３２９形成ＦⅦ蛋白近羧基端的一个二硫键，
位于ＦⅦ的，ｒＦ结合区和催化区，对维持ＦⅦ的稳
定性和功能起关键性的作用。Ｃｙｓ一３２９被Ｇｌｙ替代
后，将不能形成该二硫键，从而影响ＦⅦ蛋白的稳定
性以及功能。为了验证这一推测，我们以ＦⅦ野生
型和Ｃ３２９Ｇ突变型真核表达载体，转染ＢＨＫ，２１细
胞进行体外表达，并对表达产物进行凝血活性检测。
结果表明，突变型ＦⅦ基因转染ＢＨＫ一２１细胞的培
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中国实验诊断学２００８年４月第ｌ２卷第４期
养上清无凝血活性（其ＰＩ＇值大于空载体质粒对照
孔），而野生型ＦⅦ基因转染细胞的培养上清可测出
较高的凝血活性。提示Ｃ３２９Ｇ突变型ＦⅦ的表达和
分泌不受影响，而是突变型ＦＶＩＩ的结构异常导致其
丧失了凝血活性，此为ＦＶＩＩ Ｃ３２９Ｇ突变导致遗传性
凝血因子Ⅶ缺乏症发病的分子机制。
参考文献：
【１］吴玉水，杨文西，方国安，等．遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症一家系
基因分析［ｊ］．中华医学杂志，２０００，８０（１２）：９０４．
文章编号：１００７—４２８７（２００８）０４—０５４１—０２
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［２］吴玉水，朱晓辉，程烽，等．凝血因子ＶＩＩ基因突变的检测［Ｊ］．
临床检验杂志，２００１，１９（１）：２９．
［３］徐元斌，朱晓辉，王德春，等．液体凝血活酶试剂的研制［Ｊ］．临床
检验杂志，１９９８，１６（２）：１０４．
［４］李极品，连云宗，吴玉水，等．体外定点突变法构建凝血因子Ⅶ
Ｃ３２９突变型真核表达载体［Ｊ］．生物技术通讯．２００５，１６：４０９．
［５］Ｂｅｍａｒｄｉ Ｆ，Ｌｉｎｅｙ ＤＬ，Ｐａｔｒａｃｃｈｉｎｉ Ｐ，ｅｌ：ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ＣＲＭ十
ｆａｃｔｏｒⅥＩ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓ：ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｍｌｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏ—
ｍａｉｎ ｏｆ ＦｖＩＩ［Ｊ］．Ｂｒ ＪＨａ￣＇ｔｍｔｏｌ，１９９４，８６：６１０．
‘
（收稿日期：２ＯＯｒ７—０５—２４）
血细胞自动计数复检标准探讨
刘英华 ，孙景春
（１．吉林市中心医院检验科，吉林吉林市１３２００１；２．吉林大学中日联谊医院检验科）
全自动血液分析仪的普遍应用是近代血液学分
析的一次革命，它具有能提高工作效率、准确度高、
重复性好等诸多优点。但是各类血液细胞分析仪尚
不具备识别红细胞、白细胞、血小板形态的能力，不 能完全替代显微镜对血细胞的识别和分类检查。如 果完全依靠仪器的检测结果，不加以分析和复查，会 发出一定数量的错误报告，造成误诊或导致不合理 治疗…。目前，国际上还没有公认的、统一的复检标 准，基本上是各血液学实验室根据自身的情况，制定 本实验室的标准。我们参照国际血液学复检专家组 推荐的４ｌ条自动ＣＢＣ（全血细胞分析）和ＤＣ复检规 则［２ｌ，结合我院具体情况，制定血细胞自动计数复检 标准，现将其临床应用情况介绍如下。 １材料和方法 １．１材料 １．１．１仪器 ＳｙｓｍｅｘＳＦ－３０００型血液分析仪及配套 试剂。ＯＬＹＭＰＵＳ显微镜及ＢＡｓＯ瑞一姬氏染液。 １．１．２标本来源 自２００７年８月５日到２００７年ｌ２ 月３０日来我院就诊的门诊和住院病人血液标本共 ２１ ０００份，采用ＥＤＴＡ—Ｋ２真空抗凝管采血，采血后在 ２Ｏ分钟到２／Ｊ、时内检坝４。 １．２方法 １．２．１标准的制定参照国际血液学复检专家组 推荐的４１条自动ＣＢＣ和ＤＣ复检标准规则，结合我 ＊通讯作者 院具体情况，以保证全血细胞分析结果的准确性为 原则，同时兼顾工作效率，减少不必要的工作负担。 首先制定复检标准草案，经过试运行，进行应用效果 的评价分析，根据大家的意见，对草案反复修改，最
终总结出大家认可的血细胞自动计数复检标准。
１．２．２标准的评估对实施标准后的血细胞自动
计数结果和复检结果进行分析，判断其合理性、有效
性、实用性。
１．２．３经过复检发现异常的判断标准①仪器状
态不正常，致使仪器报告结果有误。②标本不符合
要求，致使仪器报告结果有误。③ＷＢＣ：形态异常
（中性粒细胞分叶过多、过少、核畸形，浆中颗粒增
多、减少、中毒颗粒、空泡变性、等异常形态），中性杆
状核＞５％，异型淋巴细胞：＞５％，分类异常，存在不
成熟幼稚细胞。④ＲＢＣ：存在有核红细胞，大小异
常，染色、形态异常，红细胞凝集等。⑤ＰｌＬＴ：血小板
聚集，严重体积异常等。⑤涂片中发现其他异常（如
寄生虫）。
２结果
２．１复检标准
２．１．１复检条件（１）ＷＢＣ、ＲＢＣ、ｌｉｂ、ＰＬＴ无结果。
（２）Ｈｂ：首次结果＜７０ ｇ／Ｌ或＞其年龄和性别参考
范围２Ｏ Ｌ。（３）ＭＣＶ近日相差５％。（４）ＭＣＶ首次
结果＜７５ ｆｌ或＞１０５ ｆｌ。（５）ＭＣＨＣ：≥其参考范围２ｏ
Ｌ。（６）ＭＣＨＣ：＜３００ ｇ／Ｌ，同时ＭＣＶ正常或增高。
（７）仪器报警提示，散点／直方图异常。（８）ＲＤＷ：首
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