_基因工程复习重点

基因工程期末复习 第一章：基因工程 1. 定义：通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动称为基因工程。 2. 基因工程研究的主要内容或步骤： 基因克隆的通用策略 ：涉及的过程可用分/合成、切、连、转、选、鉴。 ①从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段； ②在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子； ③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖； ④从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆； ⑤从筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用； ⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 3.三大元件：载体、质粒、片段。 第二章：分子克隆工具酶 1、工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA修饰酶、核酸外切酶、单链核酸内切酶。 2、限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。三种（Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶） 3、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。三种（） 4、回文结构：双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，每条单链以任一方向阅读时都是一样的。 5、同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶可能进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 6、同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。 7、影响核酸内切酶活性的因素：①DNA浓度②DNA的甲基化程度③酶切消化反应的温度（大多数酶的标准反应温度37度）④DNA的分子结构。 星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性（star activity)。 8、Ｔ4连接酶：该酶常从Ｔ4噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ4噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ4连接酶。 9、影响连接酶作用的因素 ①反应温度：连接缺口的温度：37℃；连接粘性末端的最佳温度： 4～15 ℃。 ②Ｔ4DNA连接酶的用量：平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。ATP的用量10μmol~1mmol/L之间。 ③提高外源片断与载体的浓度的比值，（10～20倍）。 10、常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法。 11、DNA聚合酶：DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。依赖于DNA的DNA聚合酶： DNA聚合酶Ⅰ(全酶)；DNA 聚合酶Ⅰ大片段 (klenow片段)；耐热DNA聚合酶(Taq 酶)；依赖于RNA的DNA聚合酶：反转录酶。 12、DNA聚合酶Ⅰ活性：三种酶活性①5’ →3’DNA聚合酶活性②5’ →3’③3’→5’ 核酸外切酶活性。 13、逆转录酶：以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。5’ →3’合成DNA，无3’→5’外切活性。 第三章 分子克隆载体 1、载体：将外源DNA或基因携带入宿主细胞(host cell)的工具。（克隆载体、表达载体） 来源：质粒载体、噬菌体载体、人工染色体载体、病毒载体。 二 .质粒：染色体外的遗传因子，能自我复制，多数为双链闭环DNA，大小1KB-200KB 外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低。 三大特性：自我复制、克隆位点、筛选标记（其他如易分离纯化，具有启动子） 1、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 2、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS）。 3、有适合的标记，易于选择。 表达性质粒载体：按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。 主要包括：大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。 1.构型：SC型共价闭合环形DNA（ccc DNA）、OC型开环DNA（ocDNA）、L 型线性DNA。 2.质粒DNA的复制类型：（拷贝数的多少）：严谨型、松弛型 质粒 复制子 拷贝数 pBR322 pMB1 15-20 pUC pMB1 500-700 pACYC P15A 10-212 pSC101 pSC101 -5 Co1E1 Co1E1 15-20 3.质粒的不相容性：在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种同一复制系统的质粒。也称为质粒的不相容性。 是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 4.质粒DNA的转移性：在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。 5.改造天然质粒方法： （1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择。 （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组。 （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。 （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件；方法就是重组。 6.质粒载体必须具备的基本条件： （1）具有复制起点；（replication origin）自我增值的基本条件，一般具一个复制子。 （2）具有筛选标签；理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。 （3）具有若干限制酶切单一位点（MCS multiple cloning sites ）； （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。 7.质粒载体的选择记号：抗菌素抗性（氨苄青霉素抗性基因ampr、四环素抗性基因tetr、氯霉素抗性基因Cmr、卡那霉素抗性基因kanr新霉素neor抗性基因） 8.α－互补：①lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补 ②宿主和载体各自编码的α片段和ω片段虽然没有酶活性，但是当载体和宿主细胞同时表达时，产生的α片段和ω片段发生互补，可形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶，称作α－互补 这个互补系统用来监测质粒上有无插入序列 ③蓝白斑筛选：pUC质粒 在LacZ—的大肠杆菌中，在有IPTG诱导物和X-gal生色底物的平板培养中，菌落是白色的。若在该细胞中引入pUC质粒，其上有LacZ′，质粒和大肠杆菌DNA可实现α－互补， 表达出β-半乳糖苷酶，可降解生色底物使菌落呈蓝色（有活性、阴性克隆）。 如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因，则LacZ′基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此菌落呈白色（无活性、阳性克隆）。 9.质粒DNA的分离和纯化 从细菌中提取质粒DNA的方法都包括以下三个步骤：培养细菌、收集和裂解细菌、纯化质粒DNA 三种方法：氯化铯密度梯度离心法；碱变性法；煮沸法 原理：碱变性法抽提质粒是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH12.6的高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，所以当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 流程： 1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀； 2、加入100微升冰冷的悬浮液，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，4~5mg溶菌酶）静置5分钟； 3、加入200微升微冷的裂解液（0.2NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。 4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠，振荡后，冰浴5分钟。 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖; 25mmol/L Tris-Cl(pH8.0); 10mmol/L EDTA(pH 8.0) (主要作用：Solution I 中的EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性，对DNA起到保护作用。加入solutionⅠ后一定要充分打散菌体。) 溶液Ⅱ (pH 12.6) ：0.2mol/L NaOH ;1%SDS (现用现配) (主要作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性. Solution II要新鲜配置,NaOH可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。加入solution II后放置时间不要超过5min，以免变性质粒不易复性) 溶液Ⅲ (pH 4.8) ：100ml5mol/L NaAc 60ml; 冰醋酸 11.5ml; 双蒸水 28.5ml (作用：中和碱液，质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋, 线性DNA沉淀) 三 噬菌体载体 1.基本过程：吸附、注入、合成、组装、释放 2.λ噬菌体载体（特有多极调控、9-23KB） DNA是一条线性双链DNA分子，一旦进入宿主细胞，黏性末端互补配对形成双链环