毕赤酵母表达巴曲酶发酵条件的优化研究

**:通讯作者。毕赤酵母表达巴曲酶发酵条件的优化研究薛 雁1,2,徐 梅2**,薛百忠2,王宏英2,兰海英2(11吉林大学,吉林长春 130012;21辽宁诺康生物制药有限责任公司,辽宁沈阳 110171)[摘要] 目的 对表达重组巴曲酶的巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件以获得重组巴曲酶的最高表达量。 方法 通过多因素正交实验确定巴曲酶发酵培养的最适培养条件。 结果 表达温度在25e,pH值为710,加入甲醇的量为10g/L时为最优发酵条件,诱导表达时间为84~96h。 结论 重组巴曲酶可以开发为止血药,代替临床应用的从蛇毒中提取的巴曲酶。[关键词] 重组巴曲酶;毕赤酵母;摇瓶发酵;发酵优化[中图分类号] R97713 [文献标识码] A [文章编号] 1001-5639(2009)02-0094-05StudiesonBatroxobinFermentationConditionsoftheEngineeredPichiaPastorisStrainXUEYan1,2,XUMei2**,XUEBai2zhong2,WANGHong2ying2,LANHai2ying2(11JilinUniversity,Changchun,Jilin,130012,China;21LiaoningNuokangBio2pharmaceuticalCo.,LTD,Shenyang,Liaoning,110171,China)Abstract: Objective Inordertoprovidetheoreticalbasisfortheindustrialproductionofba2troxobin.thebatroxobinfermentationconditionsofthegeneticengineeredPichiapastorisstrainKM71H/pPICZAA2Bginshake2flaskwerestudied. Methods Theoptimumconditionsareselectedbyorthogonaldesign. Results Theoptimumtemperatureis25e,pHis710.metha2nolconcentrationis10g/L,timeis84~96h.theactivityofbatroxobinwasreachedto30Ku/ml. Conclusion Recombinantbatroxobincanbedevelopingashaemostattotaketheplaceofclinicappliedbatroxobinpurifiedfromsnakevenom.Keywords: recombinantbatroxobin;Pichiapastori;shake2flaskfermentation;optimization巴曲酶(BatroxobinEC3.4.21.29)是1963年奥地利学者VonKlobusitzky首次从巴西矛头蝮蛇(Bothropsatrox)毒液中分离得到的一种丝氨酸蛋白水解酶(类凝血酶)。它作用于哺乳动物血浆中纤维蛋白原A链中的Arg162Gly17间的肽键,释放出纤维蛋白肽A,从而快速地将血液中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白,这些纤维蛋白就能聚集成疏松的栓子来封闭伤口,实现快速止血的效果。同时,在体内它并不激活凝血因子Ý,由其水解产生的纤维蛋白凝块的侧链不能交联,易被纤维蛋白溶酶降解,所以不会造成血液系统的栓塞[1,2]。目前,临床应用的立止血和巴曲亭是从巴西矛头蝮蛇蛇毒中分离纯化的天然巴曲酶。韩国的YouWeon2Kyoo于2004年报道了巴曲酶在毕赤酵母中进行表达,表达量达到31431NIH/ml,从每升发酵液中可纯化得到710mg[3]。李招发等于2007年也报道了将巴曲酶在毕赤酵母中进行表达,表达量达到22Bu/ml,从每升发酵液中可纯化得到1010mg[4]。目前还没有对重组巴曲酶发酵条件进行优化研究的详细报道。本研究对表达巴曲酶的毕赤酵母KM71H/pPICZAA2Bg进行摇瓶发酵条件的研究,为发酵罐大规模表达奠定基础。1 材料与方法111 菌种 PichiapastorisKM71H及质粒pPICZAA菌株购自Invitrogen公司。表达重组巴曲酶的工程菌KM71H/pPICZAA2Bg为本实验室构建。112 培养基94蛇志JournalofSNAKE(Science&NAtureareKEytohealth)2009年第21卷第2期Vol.21No.2,200911211 种子培养基 YEPD固体培养基(每升含10g酵母抽提物,20g蛋白胨,20g葡萄糖,15g琼脂);斜面培养基为上述成分再加入2%琼脂制成。11212 诱导培养基 BMGY(每升含10g酵母抽提物,20g蛋白胨,1mol/L磷酸钾,pH610,1314gYMB,10ml甘油,4@10-4/g生物素)。11213 表达培养基 BMMY(每升含10g酵母抽提物,20g蛋白胨,1mol/L磷酸钾,pH610,1314gYMB,5ml甲醇,4@10-4/g生物素)。11214 基础盐发酵培养基 BSM(每升含2617ml85%H3PO4,0193gCa2SO4,1812gK2SO4,1419gMgSO4#7H2O,4113gKOH,40g甘油)。11215 PTM1微量盐溶液(每升含610gCuSO4#5H2O,0108gNaI,310gMnSO4#H2O,012gNa2MoO4#2H2O,0102gH3BO3,015gCoCl2,2010gZnCl2,6510gFeSO4#7H2O,012g生物素和510mlH2SO4)。113 培养方法11311 种子活化方法 从4e毕赤酵母平板上取一单菌落,在YEPD平板上划线培养2天,培养温度为30e。11312 菌体生长阶段 从活化2天酵母平板上挑选一单菌落,置于装有25mlBMGY培养基的250ml带挡板的摇瓶中,于30e,250r/min,培养至OD600=2~6(16~18h)。11313 菌体诱导表达阶段 室温下3000r/min离心5min,收集菌体,用BMMY重悬菌体,使OD600=110左右;用双层纱布封口,放置于250r/min的摇床上继续生长;初始条件是30e,250r/min,甲醇浓度为015%,诱导表达时间是72h。每24h加1次甲醇,12h取1ml菌液,置于115mlEP管中,8000r/min离心3min,收集上清,测定凝血活性。114 细胞光密度(OD)分析 发酵液离心去上清,用去离子水稀释后于波长600nm处测OD值(OD值<1),以去离子水为对照进行。OD600=OD读数@稀释倍数。115 血浆凝血活性测定 采用同类产品活性测定方法进行体外凝血试验。实验方法为:取人2枸橼酸抗凝血浆012ml,加入直径1cm试管中,置37e水浴中保温3min,加入37e预热的样品溶液012ml,立即混匀计时,于40s开始,检查血浆凝固情况,记录初凝时间,同时测定3管,3管的初凝时间误差应<20s(若初凝时间<40s,则适当稀释供试品溶液),记录(60?20)s内凝固的供试品溶液浓度。在上述条件下,能使012ml人2枸橼酸抗凝血浆在(60?20)s凝固的酶量,定义为一个克氏单位(Ku)。2 结果培养条件的研究设计按单因子顺序进行,各项实验重复3次,每项优化结果都用于以后的实验。211 诱导表达培养基pH对KM71H/pPICZAA2Bg表达巴曲酶的影响 见图1。用pH310、410、510、610、710和810的BMMY甲醇培养液进行诱导表达实验。由于酵母菌本身产酸,因此在培养过程中每12h需要加入氨水调节pH。

从图中可以看出,pH为710时,此时上清液中的总活力最高,目的蛋白质的表达量最高。蛋白表达的最佳pH值为710,可能与目的蛋白的性质有关,巴曲酶酶活最适pH为710,低pH会影响其活性。同时在pH为710时也避开了酵母自身分泌的蛋白酶Kex2的最适pH(515),减少对表达的巴曲酶的降解,因此也就提高了蛋白的表达。所以pH710是KM71H/pPICZAA2Bg表达重组巴曲酶的最适pH。212 诱导表达温度对KM71H/pPICZAA2BgKM721H/pPICZAA2Bg表达巴曲酶的影响 分别在20e、25e和30e进行诱导表达,见图2。

从图2可以看出,在25e发酵表达的巴曲酶血浆凝固时间最短,活性最高,所以在25e时蛋白表达量最大。温度对毕赤酵母发酵产物的活性、发酵液的物理性质(溶解氧量、基质的分解吸收速率等)及生物合成方向都有影响。从酶动力学角度看,温95蛇志JournalofSNAKE(Science&NAtureareKEytohealth)2009年第21卷第2期Vol.21No.2,2009度升高,反应速率加大,生长代谢加快,生产期提前。但温度过高,又会使酶因热而失去活性,温度越高酶失活越快,表现菌体易于衰老,发酵周期缩短,影响产物产量。213 甲醇浓度对KM71H/pPICZAA2BgKM71H/pPICZAA2Bg表达巴曲酶的影响 分别用5、10、20、30g/L的甲醇进行诱导表达,见图3。

在摇瓶条件下,甲醇浓度在5g/L范围内,目的蛋白表达量较高;在10g/L时达到最大。随着甲醇浓度的继续升高,目的蛋白表达量开始下降,目的蛋白表达量及细胞光密度显著下降,可能是诱导阶段甲醇浓度过高,对细胞产生损伤,从而影响目的蛋白的表达。所以在摇瓶培养条件下最有利于目的蛋白表达的甲醇浓度为10g/L。根据invitrogen的表达手册,摇瓶培养时,甲醇浓度高于5g/L时就有可能对细胞产生毒性作用。但从摇瓶试验中,我们可以看出,重组菌株对于甲醇的耐受性很高,分析原因可能为在摇瓶培养时,甲醇是分批加入的,而不是流加。所以当加入的甲醇浓度为10g/L时,培养基中没有积累过量的甲醇;当甲醇浓度大于20g/L时,甲醇在培养基中开始累积,导致菌体中毒,菌体密度下降明显,同时外源蛋白的表达量也非常低。因而在摇瓶发酵的连续诱导过程中适当提高甲醇浓度,应更有利于目的蛋白的表达。214 诱导时间对KM71H/pPICZAA2Bg表达巴曲酶的影响 按照上述确定的诱导表达条件进行表达,直到血浆凝固活性不再提高,终止表达,见图4。当发酵至96h时,巴曲酶的表达开始进入平台期;在发酵至108h时,菌体密度已经开始明显下降,但重组巴曲酶的凝血活性达到最大值,但增加的不是很多;108~120h之间巴曲酶的表达量开始下降,因此选择诱导表达96~108h之间终止发酵。215 正交试验 根据上述单因素的实验结果,利用正交助手Ò软件进行正交试验设计,选择了以pH、诱导温度、甲醇浓度、诱导时间为影响因素,通过四因素三水平正交试验确定毕赤酵母产酶的最佳条件,正交设计及结果见表1。从表1可以看出,在pH、诱导温度、甲醇浓度、诱导时间四个因素中,影响毕赤酵母工程菌巴曲酶表达的因素次序是甲醇浓度>pH>诱导温度>诱导时间。经优化后,工程菌表达巴曲酶的最佳培养条件组合为pH710,诱导温度25e,甲醇浓度1%,诱导时间84h。表1 正交实验设计及结果因素pH值温度(e)甲醇浓度(%)时间(h)血浆凝固时间(min)161523015843026152511096123615281151082847102311010810571025115841567102801596257715231159630871525015108349715281108418均值123133323133329166721100-均值2161667201333131333221333-均值327133323166724133324100-极差101666313341613343100- 从表中四因素极差分析比较可知,本实验中三个因素对酵母菌生长的影响程度为甲醇浓度>温度>诱导时间。另外,根据表中三组均值的大小确定诱导表达条件最优组合为:pH710,温度25e,甲醇浓度1%,诱导时间84h。这与单因素试验后所得出结论基本一致,只有诱导表达时间提前到84h,但相差不显著。216 KM71H/pPICZAA2Bg摇瓶发酵 按照上述优化条件进行诱导表达。用三氯醋酸浓缩蛋白,经SDS2PAGE电泳鉴定表达产物,见图5。从电泳图中可以看出,在分子量约为33kDa处有表达的巴曲96蛇志JournalofSNAKE(Science&NAtureareKEytohealth)2009年第21卷第2期Vol.21No.2,2009