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斑点杂交法检测

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斑点杂交法检测结核分枝杆菌临床应用价值探讨
作者：陆文英 作者单位：江苏省盐城市慈航医院， 江苏 盐城 224001
【摘要】 目的：探讨斑点杂交法检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法:用抗酸染色法、
L-J培养法、PCR法和斑点杂交法平行检测76例临床标本和28种标准菌株。 结果:46例肺
结核患者痰标本抗酸染色法、L-J培养法、PCR法和斑点杂交法结核分枝杆菌检测阳性率分
别为43.4%、50.0%、73.9%和56.5%；30例非结核患者痰标本、19种非结核分枝杆菌和9
种非分枝杆菌标准株培养法和斑点杂交法检测结果均为阴性，PCR法有3例阳性。结论:斑
点杂交法检测结核分枝杆菌方法简便，结果可靠，可用于结核病的快速诊断。

【关键词】 结核分枝杆菌 点杂交 酸染色 L-J培养
The Clinical Value of Detection Mycobacterium
Tuberculosis by Dot Blot Hybridization
LU Wen-ying, et al
(Cihang Hospital of Yancheng City, Jiangsu Yancheng 224001,China)
Abstract:Objective: To study the clinical value of detecting mycobacterium tuberculosis by
dot blot hybridization. Methods: Acid fast stain , L-J culture ,PCR and dot blot hybridization
was uesd to detect the seventy-six clinical isolates and twenty-eight kinds of normal tuberculosis .
Result:Acid fast stain L-J culture ,PCR ,dot blot hybridization was used to detect the
mycobacterium tuberculosis of sputum of forty-six pulmonary tuberculosis,and their positive rate
was 43.4%,50.0%,73.9%,56.5% respectively.The results of thirty non-pulmonary
tuberculosis ,nineteen kinds of non- mycobacterium tuberculosis and nine kinds of
non-mycobacteri which was detected by culture and dot blot hybridization were all negative. The
results of three specimens were positive when they were detected by PCR.Conclusion:Using dot
blot hybridization to detect mycobacterium tuberculosis is simplified and the results is reliable. It
can be uesd to rapid diagnosis of TB.
Key words: Mycobacterium tuberculosis; Dot blot hybridization; Acid fast stain; L-J
culture
近年来结核病的发病率大幅提高，为早期、快速、准确诊断结核病，我们建立了斑点杂
交法直接检测痰标本中结核分枝杆菌，并应用于临床，同时与传统的涂片抗酸染色法、L-J
培养法、PCR法进行平行观察，以探讨其临床应用价值。
1 材料和方法
1.1 菌种来源: 19种非结核分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所，9种非分枝
杆菌来自中国科学院微生物研究所。
1.2 标本来源：46例结核病人痰标本来自2004年至2006年盐城第一人民医院门诊病
人和盐城市第二人民医院门诊、住院病人，所有病人均经培养或临床证实患有活动性肺结核，
30份非结核病人痰标本来自盐城第一人民医院呼吸科住院病人。标本采集后平行做4项检
查，首先集菌涂片镜检，余下标本经3%NaAC-NaOH处理后分别用L-J培养法、PCR法、
斑点杂交法进行检测。
1.3 试剂和仪器：斑点杂交法所用探针由上海生工公司合成，其5＇端以地高辛标记，
探针序列：5＇-GGT GGA AAG CGC TTT AGC GGT-3＇。FQ-PCR试剂由深圳匹基公司提供，
扩增仪为罗氏公司light cycle型。
1.4 方法
1.4.1 斑点杂交法：根据结核分枝杆菌16s rRNA保守序列设计探针，其5′端以地高
辛标记，标本经3%NaAC-NaOH 消化后，常规异硫氰酸胍裂解，酚-氯仿抽提，异丙醇沉淀
法提取结核分枝杆菌rRNA，将抽提的rRNA纯化后直接点样于硝酸纤维膜上，用地高辛标
记探针杂交，酶呈色观察结果。
1.4.2 FQ-PCR法，严格按试剂说明书操作，同时作阳性，阴性对照。
1.4.3 集菌涂片抗酸染色法采用结核病诊断细菌学检验规程［1］推荐方法，痰培养采
用L-J培养法［1］。
1.5 统计学处理:采用PEMS3.0统计软件对数据进行X
2 检验。
2 结 果
2.1 四种方法平行检测结核患者痰标本中结核分枝杆菌，结果表明，集菌涂片镜检法，
L-J培养法、PCR法、斑点杂交法结核分枝杆菌的检出率分别为43.4%(20/46)、50.0%(23/46)、
73.9%(34/46)、56.5%(26/46)，结果见表1。表1 46例临床标本斑点杂交法与其它三种方法
平行检测结果（略）
2.2 30例非结核呼吸系统疾病患者痰标本和牛分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海鱼分枝
杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、苏加分枝杆菌、胃分枝杆菌、次要分枝
杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌、偶然分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、龟分
枝杆菌龟亚种、不产色分枝杆菌、母牛分枝杆菌、浅淡黄分枝杆菌、草分枝杆菌、金黄色葡
萄球菌、表皮葡萄球菌、假白喉杆菌、草绿色甲链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓假单胞菌、卡
他球菌、大肠埃希菌、肺炎球菌检测结果显示，培养法、斑点杂交法均为阴性，PCR法有3
例阳性,培养法、斑点杂交法特异性为100%，而PCR法特异性为94.8%(55/58)。
3 讨 论
斑点杂交法根据结核分枝杆菌菌体内含有大量rRNA的特点，直接将细菌的rRNA抽提
后，点样于硝酸纤维膜上，用地高辛标记探针杂交，酶呈色观察结果，目前国内尚未见报道。
由于rRNA在细菌死后极易降解，一般认为只存在于活菌菌体内，故阳性具有结核分枝杆菌
活菌的诊断价值［2］。该法采用探针杂交的方法，具有较高的特异性，同时又采用酶呈色观
察结果，使杂交信号得以放大，提高了灵敏度，有一定的推广应用价值。
传统的结核分枝杆菌检测方法主要有集菌涂片法和培养法，涂片法具有简便、快速、
价廉的特点，但检出率较低，并需进一步试验才可确定是否为结核分枝杆菌，同时它不能鉴
别菌体的死活。培养法一直被作为结核分枝杆菌检测的金标准，然而检测时间长，不适合临
床早期诊治的需求，同时影响其检出率的因素较多，易造成漏诊。近年来兴起的PCR方法，
大大提高了检出率，但假阳性率较高，又有假阴性，从而影响其临床应用［3］。实验结果显
示，斑点杂交法检测结核患者痰标本中结核分枝杆菌，检出率为56.5%，高于集菌涂片法
（43.4%）和培养法（50.0%），低于PCR法的73.9%；30例对照组、19种非结核分枝杆菌
和9种非分枝杆菌标准株检测结果显示，斑点杂交法、培养法均为阴性，特异性为100%，
而PCR法有3例阳性，特异性为94.8%，由此可以看出，斑点杂交法检测时间短，结果准
确，且不会像PCR检测出现假阳性，可以用结核病的快速诊断。
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【参考文献】
［１］中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程［Ｊ］.中国防痨杂志，1996，18：28
－31.
［２］王易伟，钟敏，胡频频.rRNA扩增直接检测结核分枝杆菌的临床应用价值探讨［Ｊ］.
中华检验医学杂志，2005，28（5）：543-544.
［３］赵铁军，杨玉敏，杨军等.PCR-微孔板反向杂交法在结核分枝杆菌检测中的应用
［Ｊ］.上海医学检验杂志，2003，18（3）：185-186.
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学术交流与讨论，仅供参考不构成任何学术建议。

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病毒感染实验诊断

病毒感染实验诊断

病毒感染实验诊疗1.（ 1 ）一般原则是特异敏感、迅速和简易。

第一依据流行病学和临床特色，初步判断可能感染的病毒。

（2）而后依据可疑病毒的生物学特色、机体免疫应答和临床过程，以及病人目前所处的机遇，确立实验诊疗方法。

2.（1）对潜藏期短，发病时还没有抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。

（2）对潜藏期超出十天的感染，可检测特异性的 IgM 抗体来进行早期迅速诊疗，及差别首次和再次感染。

（3 ）对可在体内形成连续感染或潜藏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG 抗体有无 4 倍以上涨高，或直接检测病毒核酸。

（4）对原由不明或有新病毒感染时，应收集标本进行病毒分别，同时应采纳双份血清以确认分其余病毒为病原体。

（5）对同一症状可有多种病毒惹起的状况，应同时检测几种有关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体。

（6）对由多个型别构成的病毒可测定它们的共同抗原。

第一节标本收集与运送一、标本的收集1.采样时间：尽可能在发病的早期，急性期或患者人院的当日进行。

2.标本种类的选择：依据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感得病毒种类，选择相应部位采纳标本。

常有分别病毒标本的选择：3．常有标本的收集方法(1) 血液：以无菌取抗凝血10ml 。

抗凝采纳100n ／ ml 肝素钠。

用于分别CMV 、HSV ，、黄病毒、 EBV、 HIV-1及重生儿肠道病毒。

(2) 脑脊液：以无菌取脑脊液 1 ～ 2ml ，冰浴立刻送检。

在 4 ℃可寄存72h 。

用于分别柯萨奇病毒、 ECHO 病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。

(3) 宫颈或阴道拭子：采纳病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm 逗留 5 秒拿出，冰浴立刻送检。

用于分别HSV 、 CMV 。

(4)粪便标本：取 2 ～4 ｇ粪便加 10ml 运送液立刻送检，用于分别腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。

(5) 含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。

用于分别流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV 等。

HPV临床常用检测方法

HPV临床常用检测方法

由于HPV不能在体外细胞培养，故不能用简便的血清血检测进行HPV的诊断和分型.临床上用于检测HPV的方法包括细胞学方法、免疫组化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹和PCR 等,其中以PCR方法的敏感性最高，是目前应用最多感染的HPV型别、含量、持续时间决定病变的发展与预后,是进行HPV检测的主要内容.目前主要是通过应用分子生物学方法进行HPV DNA的检测.1、现有的HPV实验室主要检测手段:①聚合酶链反应（PCR, Polymerase Chain Reaction):扩增位于两段已知序列之间的DNA片断的方法。

该法有较高的敏感度，可进行HPV分型,缺点是对实验室环境要求较高，容易发生样本间的交叉污染，从而导致假阳性率高。

②核酸杂交检测有较好的特异性和敏感度，还可以进行HPV DNA的分型，各种核酸杂交检测方法有一定的优缺点.A核酸印迹原位杂交适用于HPV分型和HPV DNA分子量鉴定，虽然灵敏度高,但因操作复杂，需要新鲜组织标本,不便在临床上大规模使用。

B斑点印迹其敏感度和特异性均低于核酸印迹原位杂交法,虽然经济实用，但实验过程存在有放射性污染，是环保所不能轻视的问题.C原位杂交（in situ hybridization,一种核酸杂交技术，可用来测定基因或特定核苷酸序列在核酸分子的所在部位，检测重组体DNA）通过非放射性探针对石蜡组织进行检测，能作定位检测，假阳性率低,但灵敏度不高,大大降低了临床使用价值。

D杂交捕获法(Hybrid Capture）杂交捕获试验是利用化学发光对抗体捕获的信号加以放大.首先使DNA双链释放并分解成为可以杂交的核苷酸单链，DNA单链与RNA组合探针结合为RNA-DNA杂合体,特异性抗体将RNA—DNA杂合体捕获，偶联有碱性磷酸酶的第二抗体与RNA—DNA杂合体结合,碱性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量,从而确定RNA—DNA杂合体的含量。

能检测13种高危型HPV,包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68.各种检测方法的比较各种检测方法的比较HPV基因分型检测试剂盒（PCR—反向点杂交法）【产品用途】对人乳头瘤病毒（HPV）的感染情况进行定性检测并加以分型,能够检测23种HPV基因型，直接提示感染HPV的基因型;包括18种高危和5种低危型,可用于临床HPV感染的辅助诊断。

HPV临床常用检测方法

HPV临床常用检测方法

由于HPV不能在体外细胞培养,故不能用简便的血清血检测进行HPV的诊断和分型。

临床上用于检测HPV的方法包括细胞学方法、免疫组化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹和PCR 等，其中以PCR方法的敏感性最高，是目前应用最多感染的HPV型别、含量、持续时间决定病变的发展与预后，是进行HPV检测的主要内容。

目前主要是通过应用分子生物学方法进行HPV DNA的检测。

1、现有的HPV实验室主要检测手段:①聚合酶链反应（PCR, Polymerase Chain Reaction）:扩增位于两段已知序列之间的DNA片断的方法。

该法有较高的敏感度，可进行HPV分型,缺点是对实验室环境要求较高，容易发生样本间的交叉污染，从而导致假阳性率高。

②核酸杂交检测有较好的特异性和敏感度，还可以进行HPV DNA的分型，各种核酸杂交检测方法有一定的优缺点.A核酸印迹原位杂交适用于HPV分型和HPV DNA分子量鉴定,虽然灵敏度高，但因操作复杂,需要新鲜组织标本，不便在临床上大规模使用。

B斑点印迹其敏感度和特异性均低于核酸印迹原位杂交法,虽然经济实用，但实验过程存在有放射性污染，是环保所不能轻视的问题。

C原位杂交（in situ hybridization,一种核酸杂交技术，可用来测定基因或特定核苷酸序列在核酸分子的所在部位，检测重组体DNA) 通过非放射性探针对石蜡组织进行检测,能作定位检测,假阳性率低,但灵敏度不高,大大降低了临床使用价值。

D杂交捕获法（Hybrid Capture)杂交捕获试验是利用化学发光对抗体捕获的信号加以放大。

首先使DNA双链释放并分解成为可以杂交的核苷酸单链,DNA单链与RNA组合探针结合为RNA-DNA杂合体，特异性抗体将RNA—DNA杂合体捕获,偶联有碱性磷酸酶的第二抗体与RNA—DNA杂合体结合，碱性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂合体的含量。

能检测13种高危型HPV,包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68.各种检测方法的比较各种检测方法的比较HPV基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法）【产品用途】对人乳头瘤病毒(HPV）的感染情况进行定性检测并加以分型，能够检测23种HPV基因型，直接提示感染HPV的基因型;包括18种高危和5种低危型，可用于临床HPV感染的辅助诊断。

基因工程(基因工程的主要技术与原理分子杂交技术)

基因工程(基因工程的主要技术与原理分子杂交技术)

通过放射自显影或生化检测， 就可判断滤膜上是否存在与探针 同源的DNA分子及其分子量。
Southern杂交主要用来判断某 一生物样品中是否存在某一基因， 以及该基因所在的限制性酶切片 段的大小。（DNA水平）
Southern杂交也可检测目的基 因的拷贝数。
CK 1 2 3 4 5
Southern bloting
这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面 可以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以 检测出目标蛋白质的分子量，从而直观的在滤膜上显 示出目标蛋白。
五、Dot blot hybridization
1、原理：
在Southern杂交的基础上发展起来的用于 快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸 样品直接转移到适当的滤膜上，然后进行杂 交检测。
凝胶
3）转移并固定到滤膜上
通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝 胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后 通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。
Southern blotting 装置示意图
4）探针的制备及杂交
预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预 杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜 本身对探针的吸附。
当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交, 便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分 子具有同源性的核酸分子。这个标记的核酸 分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以 是RNA，或合成的寡核苷酸。
二、基本过程
1、核酸印迹（Nucleic acid blotting): 将核酸样品（DNA、RNA或蛋白质）在凝胶
在1975年，由英国的E. Southern首先设计发明的， 因此又称为Southern杂交（Southern blotting)。