动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立-080125

4、透析袋或膜式生物反应器
膜式生物反应器
在动物细胞培养过程中，会产生一些代谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产物的产生 会产生抑制作用，因此有些学者设计了透析袋或膜式反应器，它们可将这些有害代谢产物透 析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使 产物保留在膜内或与细胞分离开。
3、中空纤 维式生物 反应器
中空纤维反应器
由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤 维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为50100 m，呈多孔性，内层为超滤膜，内腔直径为 200 m，两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一 起，并使内腔开口于外加的塑料圆筒，使形成两个 隔开的腔。
1. 不能重复使用；②不能耐受高压灭菌，需用环氧 乙烷或其细胞悬浮液利于培养
4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成 新个体？
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成 新的动物个体
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细胞计数原理
细胞计数操作步 骤
1、将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片 和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左 侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细 胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备 细胞悬液。
二 动物细 胞大规模 培养：
在人工条件下（设定pH、温度、溶氧 等），在细胞生物反应器 （bioreactor）中高密度大量培养动 物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、 猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细 胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代 细胞，贴壁依赖)等。

基本操作过程是：先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法)或 化学(酶消化法)的方法分散成细胞悬液，经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适 宜培养液的培养皿(瓶、板)中，再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞 生长良好且易于观察，适于实验室研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性，一 旦细胞形成单层，生长就会受到抑制，细胞产量有限。如要继续培养，还需将已形 成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传代培养。
3、半连续式培养(Semi-continuous culture) 半连续式培养是在分批式培养的基础上，将分批培养的培养 液部分取出，并重新补充加入等量的新鲜培养基，从而使反 应器内培养液的总体积保持不变的培养方式。 4、连续式培养(Continuous culture) 连续式培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行 培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将 反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。与 分批式培养不同，连续式培养可以保持细胞所处环境条件长 时间地稳定，可以使细胞维持在优化的状态下，促进细胞的 生长和产物的形成。由于连续式培养过程可以连续不断地收 获产物，并能提高细胞密度，在生产上已被应用于培养非贴 壁依赖性细胞。
传代培养：把原代培养增殖的细胞定期用
胰蛋白酶把细胞从瓶壁上脱离出来，配制 悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶 中培养，这称为传代培养。
细胞株：原代细胞和50代前的传代细胞叫做
细胞株。
细胞系：50代后，遗传物质发生了改变，
并且有癌变的特点，无限传下去的传代 细胞。
细胞株
细胞系
细胞悬浮液 10代细胞
动物胚胎或 幼龄动物的 器官、组织
胰蛋白酶
制成
剪碎 单个细胞 加培养液

营养 条件
动物细胞培 养所需的基
本条件
其他 条件
无菌、无毒的环境 适宜的温度、pH和渗透压 适宜的气体环境
动物细胞培养的条件
1.营养条件: 合成培养基 + 血清等天然成分
(1)合成培养基:将细胞所需的营养物质按_种__类__和__所__需__量__严格配制而成。
营养物质主要包括：糖类、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、 微量元素等。
1.动物细胞培养的条件 2.动物细胞培养的过程 3.干细胞培养及应用
动物体 取出
组织
分散
单个细胞
适宜 条件
细胞生长和增殖
原理：细胞增殖（有丝分裂）
动物细胞培养的条件
一般来说，动物细胞培养（模拟体内细胞正常生长增殖的环境）需要满 足以下条件：
①糖类、 ②氨基酸、 ③无机盐、 ④维生素……
充足的营养、稳定的内环境
干细胞培养及其应用
干细胞：动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞，这些细胞 叫作干细胞。 干细胞存在于__早__期__胚__胎___、_骨__髓______和____脐__带__血__等多种组织和器官中 干细胞类型__胚__胎_干__细__胞__（__E_S_细_胞__）__和__成_体__干__细_胞_________
多种体细胞 临床治疗人类疾病 如：白血病、帕金森病、阿而茨海 默病等
干细胞培养及其应用 思考1：制备iPS细胞的其它方法有哪些？
①借助载体将特定基因导入细胞中； ②直接将特定蛋白导入受体细胞中； ③用小分子化合物来诱导形成iPS细胞。
思考2：干细胞用于临床治疗面临的问题有什么？
如存在导致肿瘤发生的风险
传代培养
②利于与培养液充分接触，保证O2与营养供应 和代谢物及时排出。

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原代细胞的分离和制作
人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细 胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于 周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块 充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：
一、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方 法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时 间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞， 离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓 度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液， 因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这 样可根据需要收获目的细胞 ．
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二、实体组织材料的分离方法
（一）机械分散法
所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分 散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头 压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此 法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适 用于处理纤维成分少的软组织。
肿瘤学、病毒学、分子生物学
等领域已得到广泛的应用。
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动物细胞培养基本流程
剪碎，胰蛋白酶
动物组织 分离细胞
单个细胞 原代培养
原代细胞 传代培养
细胞株 （遗传物质没有发生改变）
细胞系 （遗传物质发生改变） 4
细胞培养的材料准备 1 细胞培养液 2 胰酶消化液 3 PBS缓冲洗涤液 4 洁净无菌的细胞培养瓶、培养板
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细胞培养基应用选择精要