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实验三鱼类原代细胞的制备与培养（组织块法）姓名：程辉辉学号：2014308110001【实验目的】掌握贴壁细胞原代培养的方法；熟悉贴壁细胞原代培养流程【实验原理】细胞培养可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取和切割成微小的组织块，然后贴附于培养瓶底部，并有培养液供给营养，在合适的温度中孵育，让其慢慢地长出细胞来，以获得大量均一的细胞，为以后传代培养创造条件。
【器材、材料与试剂】（一）仪器生化培养箱，倒置显微镜，超净台，加液枪。
（二）材料培养瓶，平皿，5m L移液管，15ml、50ml离心管，纱布块，穿刺针，废液缸，手术剪镊，无菌解剖刀，75%酒精，50ml小烧杯，试验幼鱼。
酒精棉球，酒精灯，橡皮头，软管，记号笔。
（三）试剂AIM：90 mL培养液+ 5 mL GPS（10×）+5 mL两性霉素B（250μg/mL）+1 mL硫酸庆大霉素（50 mg/mL）混合，4℃保存；原代培养液：80 mL培养液+2 mL GPS (10×)+20 mL FBS+ 表皮生长因子EGF（2μg/mL）+ 成纤维生长因子FGF（25 ng/mL）混合，4℃保存；传代培养液：90 mL培养液+1 mL GPS (10×)+10 mL FBS混合，4℃保存【实验步骤】工作前打开紫外灯，消毒30分钟；入无菌室之前用肥皂洗手（或带手套），用75%的酒精擦拭消毒双手；超净台面应整洁，用75% 酒精喷洒，纱布擦净；所有试剂瓶等培养用具需用酒精擦拭后放入超净台。
将灭菌的手术器械（解剖刀2把，镊子一把，眼科镊一把，眼科剪一把）插入盛有75%酒精的玻璃小烧杯中浸泡和备用。
以下操作均在超净台里。
首先用5ml 移液管吸AIM（消毒培养液）到无菌平皿中。
1. 杀幼鱼与消毒体表：将小幼鱼置于75%酒精中，浸泡30秒。
2. 取鳔：继续用消毒纱布托住鱼体，用手术剪取鳔，并置于盛有AIM培养基的培养皿（1）内浸泡消毒，写上组织编号。
绪论一．海洋生物技术定义：运用海洋生物学与工程学的原理和方法，利用海洋生物或生物的代谢过程生产有用物质或定向改良海洋生物遗传特性的综合科学技术。
二．重点发展领域：1.发育与生殖生物学基础2.基因组学与基因转移3.病原生物学与免疫4.生物活性及其产物5.海洋环境生物技术三．最新研究进展：动物细胞培养一、细胞培养：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
二、细胞培养基本过程：取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。
将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。
当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。
此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。
再配成一定浓度的细胞悬浮液。
另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。
当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。
通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株。
当培养超过50代时，大多数的细胞已经衰老死亡，但仍有部分细胞发生了遗传物质的改变出现了无限传代的特性，即癌变。
此时的细胞被称为细胞系。
三、原代培养：从供体取得组织细胞后在体外进行首次培养四、传代培养：即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖五、细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞六、细胞系：原代培养的细胞顺利传至40--50代，并保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，这种传代细胞成为细胞系动物细胞融合技术1.细胞融合：是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。
鱼类育种学概述摘要：鱼类遗传育种的途径和范围是非常广泛的，包括常规的选择育种、杂交育种、多倍体育种以及新近发展起来的细胞工程育种和转基因育种。
本文就这些方面对鱼类的育种进行综述。
关键词：选择育种杂交育种多倍体育种细胞工程育种转基因育种鱼类育种是对野生或现有品种进行遗传改造，创造自然界所未有的鱼类新品种，是对鱼类多样性和物种进化的贡献。
20世纪70年代以后，鱼类育种与细胞工程和基因工程等新高生物技术的结合，使这一研究领域很快出现生机，冲破了多年来常规的选择育种和杂交育种在育种多样性和快速高效等方面的制约。
我国较大规模开展鱼类遗传育种研究的历史仅有20多年。
短短20多年来，不但在育种技术方面取得了重大进步，建立了杂交、倍性、细胞工程以及基因工程等多种育种技术，并逐渐形成了多种技术综合配套的技术路线。
通过传统的育种技术和现代的育种技术成功地培育出新的鱼类品种，如工程鲫、工程鲤等，不断向社会推出了许多具有重要经济价值的养殖新对象，大大提高了鱼类的生产力，丰富了鱼类的遗传多样性。
鱼类遗传多样性的丰富反过来又可增加鱼类生产量和改良鱼类品种，因此，保护基因多样性和可持续的利用是人类维持基本的生命过程和生命支持系统的基础。
1 选择育种选择育种是育种工作的一个最基本的手段[1,2]。
改变育种对象遗传性质的常规方法有两种：一是挑选作为亲本用的个体，这就是选择。
另一个是控制亲本的交配方式，这就是遗传操作。
在鱼类生长发育的各个阶段，可以有目的地选择具有优良性状的个体，淘汰品质不良的个体，这种方法可以避免由于鱼类人工繁殖所产生的近亲交配而随之引起的退化现象。
目前，系统选育的方法通常有4种：(1)混合选种(又称集团选种)，即从生产效果最好的池塘中选出鱼群，这种方法在鱼类的各个发育阶段都可进行；(2)家系选种(又称窝选)，即从一雌一雄选亲配合建立家系开始，在其后代中一代一代进行高度的近亲交配，以累代实行严格的全同胞交配为基础，依据个体表型值，兼顾家系平均值，进行选择留种；(3)亲本选种，又称后裔鉴定选种，即根据后代质量而对亲本作出评价的个体选择方法，根据后裔鉴定结果决定对亲本的取舍；(4)综合选种，即综合上述几种选种方法进行的选择育。
近10年鱼类细胞培养研究进展及应用展望
张博;陈松林
【期刊名称】《海洋科学》
【年(卷),期】2011(035)007
【摘要】鱼类细胞培养作为一种重要的研究手段，广泛应用于病毒学、环境毒理学、细胞生物学、肿瘤学、基因组学、遗传学以及资源保护等方面的研究。
鱼类细胞作为实验对象，有着活体鱼无法比拟的优点：（1）成本低，细胞系的维护不需要大型的养殖设备和大量的换水与充气；（2）重复性好，实验条件可以精确控制。
因此，对鱼类细胞系进行深入研究，
【总页数】9页(P113-121)
【作者】张博;陈松林
【作者单位】中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业部海洋渔业可持续发展重
点开放实验室,山东青岛266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业部海洋
渔业可持续发展重点开放实验室,山东青岛266071
【正文语种】中文
【中图分类】Q2
【相关文献】
1.鱼类细胞培养及其在病毒学研究中的应用 [J], 李文峰;麦康森;黄倢;史成银
2.鱼类神经坏死病毒的检测与细胞培养技术研究进展 [J], 彭智发;龚艳清;陈信忠
3.鱼类细胞培养技术研究进展 [J], 艾庆辉;李庆飞;麦康森
4.鱼类细胞培养的研究与应用 [J], 姜泽东; 周伯文; 段晶晶
5.鱼类细胞培养的方法、条件及应用研究概述 [J], 龙舒婷;罗鹏佗;张永馨;李旭艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实验四动物细胞的传代培养实验四动物细胞的传代培养1. 实验⽬的（1）了解动物细胞培养的基本知识。
（2）了解体外培养细胞的的基本形态类型；学会通过镜检判定体外细胞⽣长的状态。
（3）掌握动物细胞的传代培养法。
2.实验背景与原理2.1 动物细胞培养的基本概念（1）组织培养：把来⾃机体内的细胞、组织或器官放在类似于体内的外环境中，使之成活、⽣长和繁殖。
严格⼜分为细胞培养、组织培养和器官培养。
值得注意的是和植物组织培养不同，⽬前动物组织培养在⼀般培养条件下难以维持组织的结构和功能，常最终转变成为细胞培养，所以动物细胞与组织培养并⽆严格区别。
（2）原代培养：直接从供体取来的细胞，组织或器官进⾏的初次培养。
通常把第⼀代⾄第⼗代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
（3）传代培养：原代培养物长成单层细胞，达到⼀定密度时，营养消耗殆尽，需要补充营养，分开扩⼤培养，使之继续增殖。
注意的是传代的这个“代”与细胞分裂的⼀个世代不同，⼀代细胞约分裂3~5次，不要混淆。
（4）细胞系：原代培养后的细胞经传代即可成为细胞系。
若其形态均⼀，⽣长增殖稳定，⽣物性状明确，即可称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。
不同种类的细胞成系的难易程度也不同，⼀般胚胎、更新组织的细胞如造⾎、上⽪等以及癌细胞较容易成系，⽽神经等细胞则较难成系。
按照其⽣存期可分为有限细胞系（⽣存期有限的正常⼆倍体细胞）和⽆限细胞系（⽣存期⽆限的癌细胞、转化细胞等，⼤多异倍体）2.2 动物细胞培养的基本条件体外培养细胞的条件总原则就是要尽可能模拟细胞在体内⽣长的环境，因此必要的营养、适宜的胞外环境以及严格的⽆菌条件是主要的三个⽅⾯。
（1）营养：早期培养主要采⽤天然的⽣物性液体，但其成分不确定，难以控制营养成分。
现⼴泛使⽤的是化学成分明确的各种商品化的合成培养基，其主要成分包括各种氨基酸、维⽣素、⽆机盐、葡萄糖等必要的营养物质。
培养基中还含有酚红指⽰剂，使培养基的颜⾊可显⽰细胞⽣长状态。
血细胞原代培养及其形态、增殖分析1材料1.1试剂、药品培养基配制：血清使用时临时添加，培养基为DMEM培养基添加双抗。
双抗(青霉素、链霉素)终浓度均为100μg/ml。
血清为临时添加，终浓度为20%。
巯基乙醇：根据换算0.1mM的1L溶液须0.7ul巯基乙醇。
换言之，以巯基乙醇与双蒸水按70ul：930ul比例配置为母液，每100ml培养基仅需1ul双抗：先各取0.5g溶于50ml无菌双蒸水中，此时其浓度为0.1mg/ml= 10,000μg/ml,分装入250ulEP管中，此部切记EP管架。
使用时每1ml加10μL即100μg/mL。
剩余-4°冻存。
鉴于各组分均为使用时添加，故不进行单独过滤除菌。
培养基分装于250mL试剂瓶，血清分装于50mL试剂瓶。
PBS：NaCl:8g；KCl:2g; Na2HPO4·7H2O:1.15g（如果是12水合则为1.44g）; KH2PO4:0.2g 加水定容至1L，高压灭菌。
操作中使用一次性10ml滴定管，移液器1mL，100μL。
胰酶：以PBS添加0.25%胰酶配制。
过滤除菌，此步须注射一次性过滤器0.2微米。
肝素钠：取肝素钠100mg溶于10mL生理盐水中（0.9%NaCl），以10ml离心管盛装，过滤除菌。
麻醉剂：5ml丁香酚与5ml无水乙醇混溶，冻存液：无色甘油或DMSO加入含20%FBS培养基中，终浓度为10%MTT：取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可Wright-Giemsa：取两样各0.5g，甲醇500ml，配成染液台盼蓝染色液：4%台盼蓝母液，取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml滤纸过滤，4°保存。
使用时用PBS稀释至0.4%。
1.2器材离心机1、15、50ml离心管1.5、15、50ml脱脂棉、纱布、锡箔纸血细胞计数板、细胞计数器培养容器：96孔、24孔板，一次性细胞培养瓶、一次性培养皿30、60mm、载玻片、盖玻片倒置显微镜（可拍照）细胞培养箱酒精喷壶5ml、15ml一次性注射器1000、500、250ml、100、50ml试剂瓶一次性针头过滤灭菌器0.22um2方法2.1细胞培养：此步需要1ml、100ul移液枪，无菌蓝枪头1ml，无菌黄枪头100ul，2ml灭菌EP管，EP管架，5ml注射器，封口膜，无菌纱布，酒精棉球，酒精灯，打火机，酒精喷壶，一次性培养瓶，塑料餐盒。
