虫草素的提取纯化及测定方法研究进展_刘春泉

虫草隶属于肉座菌目虫草科虫草属[1]。

虫草素又名虫草菌素、冬虫夏草素,属嘌呤类生物碱,是第1个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。

虫草素结构式如图1所示,分子式为C 10H 13N 5O 3,熔点230~231℃,最大吸收波长为259nm ,碱性,针状或片状结晶。

1虫草素的药理作用Cunningham 等[2-3]于1951年发现昆虫组织如被蛹虫草寄生则不易腐烂,经研究从中分离出虫草素。

之后,众多学者对虫草素进行了研究,证实虫草素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节、改善新陈代谢、清除自由基等作用[4-5]。

Kodama 等[6]研发的以虫草素为主要成分的新药已在临床上试用于白血病的治疗,具有良好的临床应用前景。

目前虫草素的研究正成为药物化学、抗衰老、美容、保健品等领域中极其热门的一部分。

2虫草素的开发2.1虫草素的生产2.1.1虫草素的固体发酵法。

虫草素虽然可以经生物合成获得,但由于反应时间长、产量低、排放大量对人体有害的有机溶剂而不常用,通过虫草菌丝体人工培养一直是国内外的研究热点。

万涛等[7]通过正交旋转组合试验,确定蛹虫草固体发酵虫草素的最佳培养基配方为水料比1.1mL/g ,营养水中酵母膏的用量为22.6g/L 、蛋白胨的用量为6.0g/L 、葡萄糖的用量为25.4g/L ,KH 2PO 4的用量为2g/L ,MgSO 4的用量为0.5g/L ,营养水pH 值6.6。

通过正交试验,确定蛹虫草固体发酵虫草素的最佳环境条件为:光照强度4400lx ,每日光照时间18h ,温度18~22℃。

按照上述优化的培养基配方和环境条件进行固体发酵生产虫草素,经过大约13d 的培养,培养基中虫草素的含量可达到0.60%以上。

与传统液体发酵方法相比,利用蛹虫草固体发酵虫草素的最高产量比普通液体发酵的最高产量高近2倍,并且生产周期缩短2d 。

2.1.2虫草素的液体发酵法。

国内外虫草素的制备主要通过液体发酵法获取。

冬虫夏草提取物及其活性成分研究进展发布时间：2023-06-15T08:43:12.551Z 来源：《科技潮》2023年10期作者：胡航[导读] 冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座与幼虫尸体的干燥复合体。

其气微腥、味微苦，性甘、平，归肺、肾经，具有益肺补肾和化痰止血的功效。

冬虫夏草既可作为其他治疗手段的辅助单方使用，也可制成复方制剂发挥作用。

杭州中美华东制药江东有限公司摘要：冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座与幼虫尸体的干燥复合体。

其气微腥、味微苦，性甘、平，归肺、肾经，具有益肺补肾和化痰止血的功效。

冬虫夏草既可作为其他治疗手段的辅助单方使用，也可制成复方制剂发挥作用。

由于来源有限，一些临床药品和保健食品中以组分和药理作用相似的发酵虫草菌粉作为原料，多年来，冬虫夏草中的活性成分受到科研工作者持续关注。

针对冬虫夏草各种提取物及活性成分的研究进行归纳，旨在为进一步研究冬虫夏草、挖掘其价值提供参考。

关键词：冬虫夏草；提取物；活性成分一、冬虫夏草提取物1.1提取物制备方法1.1.1冬虫夏草的选择传统的冬虫夏草药材，是以其干品入药，如《中国药典》对其描述为“晒至六七成干，除去似纤维状的附着物及杂质，晒干或低温干燥”。

而不同的干燥方式对冬虫夏草活性成分含量有影响。

对比了冷冻干燥、阴凉干燥、热风烘干3种不同干燥方式对冬虫夏草中代表性成分的影响，结果表明，通过冷冻干燥制备的冬虫夏草，维持了较高的超氧化物歧化酶（SOD）的活性，而热风烘干的产品中，麦角甾醇、胆固醇、豆甾醇等含量较高。

此外，一些研究在选择原料时采用了鲜冬虫夏草，在一定程度上避免了干燥方法及工艺对冬虫夏草提取物成分的影响。

1.1.2提取方法在制备冬虫夏草提取物时，最常用的方式是浸取。

为了提高浸取效率，可以采用一些辅助手段，如热回流、超声等。

比较了加热回流提取、超声波提取及热回流辅助超声波提取，通过对比常见重金属元素、指纹图谱、部分主要/差异性成分，发现含超声方式所制得的提取液稳定性和均一性均较好、提取到的生物活性化合物种类更多。

虫草多糖的分离纯化及含量测定目的采用发酵法从冬虫夏草发酵液及菌丝体中提取、分离虫草多糖。

方法采用乙醇沉淀法分离冬虫夏草发酵液和菌丝体中的多糖；采用苯酚硫酸法测定样品中多糖含量。

结果采用此法进行制备、检测，方法简单快速，结果准确，适宜推广使用。

结论此法无需多糖纯品，具有快速简单、精确度高、灵敏度高、重现性较好的优点，是检测虫草多糖含量的较优方法之一。

标签：发酵液；虫草多糖；菌丝体虫草多糖；分离纯化；含量测定Purification and determination of Cordyceps polysaccharideCUI?Lixun1??ZHANG?Aihua1??SUN?Shouying21.Heilongjiang Biotechnology V ocational College，Harbin 150025，China；2.Heilongjiang New Yisheng Pharmaceutical Co.，Ltd，Jixi 158200，China[Abstract] Objective Using the method of inoculated fermentation to extract and separate the Cordyceps polysaccharide from the zymotic fluid and mycelium of Chinese caterpillar fungus. Methods Separated the polysaccharide of Chinese caterpillar fungus’ zymotic fluid and mycelium in ethanol precipitation；survey and evaluate the polysaccharide content of samples in phenol-sulfuric acid method. Results It is profitable for using widely because of the fast，easy method and exact result for producing and detecting. Conclusion This method is one of excellent ways for detectin g the Cordyceps polysaccharide contents and it doesn’t need the polysaccharide from pure product. The advantages are fast and easy，high accuracy and sensitivity，and good reproducibility.[Key words] Fermentation broth；Cordyceps polysaccharide；Mycelium of Cordyceps polysaccharide；Separation and purification；Content determination 冬虫夏草首载于本草从新，味甘，性温，归肺、肾经，具补肺益肾，止血化痰之功效。

北虫草多糖提取及其抗氧化、抗衰老作用研究进展摘要：北虫草是中国的传统医药，常以干燥的子实体入药，是药用价值较高的虫草菌属之一，具有药理性强、药效范围广的优点.北虫草多糖作为其主要的活性成分，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种药理作用.为提高北虫草多糖的提取率，研究多糖的药理作用，对北虫草多糖的提取工艺及其抗氧化、抗衰老作用的相关研究进行综述.关键词：北虫草多糖;提取工艺;抗氧化;抗衰老北虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草、蛹虫草，是我国传统药用真菌之一，隶属于子囊菌门、麦角菌科、虫草属，具有天然的药用价值和营养价值[1].北虫草最初被人们所熟知源于其具有显著调节机体免疫的作用，所含的活性成分已成为真菌学研究的主要热点.北虫草多糖(Cordyceps militarispolysaccharides，CMP))作为北冬虫夏草主要活性成分之一，主要是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、核糖、鼠李糖等单糖组成[2].目前，从北虫草液体发酵液、天然北虫草以及碳氮源人工培养北虫草等物质中分离纯化得到的多种多糖类化合物，在控制细胞分裂、调控细胞周期、延缓细胞衰老、提高机体免疫等方面具有重要作用，已逐渐应用于功能型食品和医药领域[3].现就近年来北虫草多糖提取工艺以及抗氧化、抗衰老活性研究进展做一综述，为北虫草多糖在保健食品以及临床实验研究中提供理论依据.1 北虫草多糖的提取工艺CMP作为天然药用成分具有多种药理活性，自上世纪初以来，便有专业研究人员对其提取工艺进行深入研究，并在近年来取得突破性进展.CMP的主要提取方法包括微波提取法、超声提取法、热水浸提法、酶解法、一步提取法、闪式提取法等[4]，不同的提取工艺其多糖提取率及多糖活性也不同.近几年，随着多糖提取工艺的不断优化，CMP生物产量得到了进一步提高.1.1 热水浸提法热水浸提法是最早应用于提取植物活性成分的传统工艺方法，具有易于操作、流程简单、穿透性强等优点[5].陈安徽等< sup>[6]采用正交试验法优化CMP 提取工艺，结果表明热水浸提法所获得的多糖得率显著优于超声提取法，CMP最佳提取工艺为浸提温度80℃、提取时间1.5h、料液比m(g)∶V(mL)=1∶20，CMP提取率达到9.31%，为CMP的提取纯化以及活性研究奠定了基础.周国海等[7]进一步优化了CMP的提取纯化工艺，以便于北虫草更好地产业化开发利用.研究表明:提取温度70℃、液料比V(mL)∶m(g)=30∶1、提取时间4h为CMP最佳提取参数，此条件下的CMP提取率为8.97%，纯度高达68.9%，很大程度上提高了多糖得率，并减少了杂质产生，为CMP的进一步开发利用提供了基础数据.热水浸提法虽操作易行，但其提取时间较长，耗费能源较多，现已被逐渐替代.1.2 超声波、微波提取法超声提取法具有提取率高、提取溶液中所含杂质少、节省原料等特点[8].孙源等[9]对CMP的提取工艺进一步优化后证明超声提取法为其最佳提取方法，在超声功率为465W、料水比m(g)∶V(mL)=1∶40、超声温度50℃、超声时间40 min 提取参数下多糖提取率可达15.48%.秦秀丽等[10]通过正交分析方法优化超声波提取CMP工艺，结果显示:在超声功率为300W、提取温度35℃、提取时间30min、料液比m(g)∶V(mL)=1∶55 条件下为CMP 的最佳提取参数，多糖提取率为 5.57% . 微波提取法具有适应性广、选择性高、运行成本低、节能等优点[11].殷东林等[12]通过微波提取法、超声波辅助法、索氏提取法以及热水浸提法对比分析发现:微波提取法是CMP最佳提取方法，并通过正交分解试验建立了CMP最佳提取工艺，即微波功率为420W、料液比m(g)∶V(mL)=1∶40、微波处理时间4min、提取次数3次，多糖提取率可达9.34%.超声波以及微波提取CMP虽省时节能，多糖得率高，但在提取过程中产生强大的剪切力和高温亦影响多糖的化学结构及生物活性，此类方法有待于进一步优化[9].1.3 酶解法酶解法具有高效性、专一性、催化作用强、作用条件温和以及环境污染少等优点，因此，更适用于工业生产[13].纤维素酶是通过破坏植物细胞壁结构以及催化不溶性纤维素转化为葡萄糖，从而起到提高多糖得率作用的一类复合蛋白水解酶.HUAN Dongyang 等[14]首次应用动力学分析研究酶辅助法优化北虫草菌丝体多糖提取条件:纤维素酶浓度2.0%、提取温度40℃、固溶比m(g)∶V(mL)=1∶20、萃取pH4.0，在此条件下多糖提取率为5.99%.葛静波等[15]利用纤维素酶和淀粉酶从新鲜北虫草子实体中提取多糖，结果表明:碱性蛋白酶是影响CMP提取率的最强因素(R=3.86)，造成这种现象最可能的原因是复合酶之间存在相互作用，以此为基础，经复合配方水解酶优化后获得的多糖提取率可达18.41%.由此可见，对复合酶进一步优化后可提高CMP生物利用率.2 北虫草多糖的抗氧化、抗衰老作用2.1体外清除自由基的活性现代研究表明:在机体正常代谢过程中所产生的活性氧自由基(ROS)，如过氧化氢、超氧阴离子以及羟基自由基等，在一定程度上会提高体内的抗氧化物酶活性，对人体产生有利的作用.但在受到外界不利因素刺激下，机体内活性氧自由基产生增多，即氧化物生产速度超出抗氧化物清除程度，导致机体偏向于氧化，并引发一系列连锁反应，如“攻击”细胞内的生物大分子蛋白质、脂质以及核酸等，造成不可逆的氧化损伤，进而加速机体衰老.因此，从植物中提取天然无毒害、具有抗氧化、抗衰老作用的多糖组分已成为学者新的研究方向.葛静波等[15]通过酶解法得到的CMP，在1mg/mL浓度下秀丽线虫最长寿命比百草枯致使氧化系统受损的线虫多存活 4d，表明CMP具有良好的抗氧化活性.葛晓宇[16]从北虫草子实体中分离纯化得到酸性多糖组分F2，在浓度为25mg/mL 时，对超氧阴离子的清除率达到75%，对羟自由基的清除率达到70%，且清除能力随多糖浓度呈依赖性增加.贾俊强等[17]经羧甲基化、硫酸化、乙酰化等化学修饰后得到的CMP均在体外表现出不同程度的抗氧化活性，其中羧甲基化和硫酸化对烷基自由基清除率分别达到95.19%和73.58%，可显著提高CMP对烷基自由基清除能力，对羟自由基和超氧阴离子自由基清除率均较乙酰化修饰后的C MP高.因此，对CMP采取适宜的化学修饰，可提高其体外抗氧化活性.2.2 体内抗氧化物酶的活性超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)是一类防御体内自由基损伤的内源性过氧化物酶，其主要功能是清除体内代谢产生的过多氧自由基，抑制脂质过氧化物丙二醛(MDA)生成，进而维护重要脏器的ROS稳态，延缓机体衰老进程.2.2.1 肝损伤的保护作用CMP对肝损伤的保护作用是通过增强肝脏中过氧化物酶含量、抑制过氧化产物丙二醛(MDA)生成以及激活巨噬细胞的吞噬功能实现的. 黄小莉等[18]研究发现:CMP可显著提高急性酒精性肝损伤小鼠肝匀浆中的还原型谷胱甘肽(GSH)活性以及降低甘油三酯(TG) 和过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量，表明CMP对急性酒精性肝损伤小鼠具有明显的保护作用.WANGLiqin等[19]通过小鼠实验证明:从北虫草SU-12中提取的RPS可显著降低血液和肝脏中脂质水平，并改善谷氨酸丙酮酸转氨酶和抗氧化物酶活性.郭丽新等[20]研究表明:在D-半乳糖诱导亚急性衰老小鼠中，CMP通过增强小鼠肝组织中SOD，CAT活力，降低MDA含量，从而减少对肝组织的损伤，达到延缓小鼠衰老的作用.2.2.2 肾损伤的保护作用王米等[21]研究显示:CMP通过增强由环磷酰胺诱导衰老小鼠肾脏中SOD和T-AOC的活性、降低MDA的含量而对小鼠肾损伤具有保护作用，并为抗衰老新药进一步研发提供新的思路.肾小球系膜细胞是一类在正常情况下不发生明显增殖活动的细胞，在受到炎症等有害因素刺激下会产生异常增生，导致肾小球毛细血管腔狭窄，加速肾小球损伤、硬化，并逐渐发展为肾衰，严重影响人们日常生活.为此，朱凯[22]将北虫草多糖提取纯化后得的5个不同组分，依次命名为CP-1，CP-2，CP-3，CP-4，CP-5，并通过药理实验筛选出其中的有效成分CP-1，并进行血清药理学实验，检测其对肾小球系膜细胞增殖的影响.研究表明:CP-1可以显著抑制肾小球系膜细胞增殖，且在2.5~5.0g/kg浓度内呈剂量依赖性，其作用可能与抑制细胞内ROS产生、增强过氧化物酶活性有关，为治疗肾功能障碍等提供理论支撑.3 问题与展望北虫草与冬虫夏草的主要活性成分及药理作用相似，其保健功能和药用价值日益被人们所认识.北虫草中的北虫草多糖富含多种生物活性，具有良好的产业化发展前景，但目前仍无法大规模、高纯度制备:一是提取工艺存在许多问题，如热水浸提法虽易于操作，但耗时耗力; 超声波以及微波提取法虽然提取率高，但可导致多糖生物活性降低;酶解法虽作用条件温和、专一性强，弥补了超声以及微波法提取多糖的不足，但价格昂贵;二是现阶段受到分析技术的限制，对多糖的结构分析仍停留在一级结构上，结构与药理活性的构效关系目前报道甚少.国内外文献中对CMP体外抗氧化活性研究较多，在抗衰老方面大多是以抗氧化物酶的研究为主，研究CMP对D-半乳糖诱导小鼠衰老的抑制作用.线粒体既是ROS 主要产生场所，也是其主要的攻击目标，ROS产生过多会引起线粒体膜电位降低，导致线粒体功能障碍，同样线粒体损伤可进一步引发ROS代谢紊乱，加速衰老进程.因此，应进一步研究CMP抗衰老作用及其相关分子机制，如CMP对线粒体的保护作用及对衰老基因的作用等，此研究可为北虫草药用资源的开发及利用提供理论依据.参考文献[1]左锦辉，贡晓燕，董银卯，等.蛹虫草的活性成分和药理作用及其应用研究进展[J].食品科学，2018，39(21):330-339.[2]邓勇，张杰良，王兰英，等.薄层色谱法分析不同虫草多糖的单糖组成[J].药物分析杂志，2018，38(1):13-21.[3]钱雯婕，常广宁，张静，等.不同栽培配方对北虫草子实体营养成分含量的影响[J].现代农业科技，2017(6):86-88.[4]陈方圆，焦子伟，努尔买买提，等.蛹虫草活性物质提取技术研究进展[J].江苏农业科学，2017，45(6):7-13.[5]TANG Yujia，XIAO Yirong，TANG Zizhong，et al. 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HPLC-DAD测定人工北冬虫夏草中虫草素含量
宋江峰;刘春泉;李大婧;金邦荃
【期刊名称】《食品科学》
【年(卷),期】2008(029)004
【摘要】建立了测定北冬虫夏草子实体中虫草素的高效液相色谱法.使用Eclipse XDB C18(4.6mm X 150mm,5μm)色谱柱,以水:甲醇:甲酸(95:4:1)为流动相,流速为0.8ml/min,25℃下检测.检测波长为260nm.结果表明:虫草素的平均回收率为100.8%,RSD值1.88%.此方法简单、可靠.
【总页数】3页(P352-354)
【作者】宋江峰;刘春泉;李大婧;金邦荃
【作者单位】南京师范大学金陵女子学院,江苏南京,2100972;江苏省农业科学院原子能农业利用研究所,江苏南京,210014;江苏省农业科学院原子能农业利用研究所,江苏南京,210014;江苏省农业科学院原子能农业利用研究所,江苏南京,210014;南京师范大学金陵女子学院,江苏南京,2100972
【正文语种】中文
【中图分类】TS207
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侯芳菲（天津生物工程职业技术学院 天津 300400）冬虫夏草中各种化学成分的检测方法冬虫夏草具有抗炎、抗肿瘤、降血糖、免疫调节、保护受损肝肾、镇静和抗疲劳等作用，冬虫夏草的化学成分复杂,近五年有关冬虫夏草化学成分测定方法的研究对象主要为核苷类、甘露醇、多种氨基酸、甾醇类及无机元素等。

1 核苷类物质的测定核苷类物质为冬虫夏草的主要活性成分之一,具有广泛的生理功能,其中以虫草素、腺苷等具有明显的药理作用。

近五年的测定方法主要为高效液相色谱法和毛细管电泳法。

1.1 HPLC方法测定中药成分非常复杂,H P L C因其具有各种分析柱、高选择性和高灵敏度的检测器，所以具备分离效能高、分析速度快、灵敏度高和适用范围广等优点，所以成为中药研究的最重要的分析方法。

郑永彪[1]等建立了冷冻保鲜冬虫夏草中尿苷和腺苷的HPLC测定方法。

采用Waters sunfire色谱柱(4.6mm×250mm，4.6μm),流动相系统为乙腈和水的比例和体积流量的梯度洗脱程序,柱温35℃,检测波长260nm。

结果尿苷和腺苷的线性范围分别为0.0340～0.340μg,0.00494～0.0494μg,平均加样回收率分别为98.70%(RSD为0.48%)、97.39%(RSD为1.6%)。

该方法简便快捷、准确精密、重复性好，能用于冷冻保鲜冬虫夏草中腺苷和尿苷的同时测定。

周伟平[2]等建立了采用Agilent EclipseXDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱摘　要：阐述近五年来冬虫夏草中核苷类、甘露醇、多种氨基酸等成分的检测方法，其中包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、分光光度法等方法。

关键词：冬虫夏草 化学成分 检测同时测定西藏产冬虫夏草中尿苷及腺苷的含量的方法，检测波长为260nm，以甲醇-水为流动相梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温33℃。

尿苷及腺苷的线性范围为32.95～439.3μg/mL(r=0.9999)和3.486～46.48μg/mL(r=0.9999)，平均回收率分别为98.5%、95.6%，RSD值分别为1.8%和2.4%(n=6)。