棉花无腺体近等基因系差异表达基因分析

opaque2玉米近等基因系蛋白差异表达研究中期报
告
针对opaque2玉米近等基因系蛋白差异表达的研究，我们已完成了中期报告。

以下是我们的研究结果和进展：
1. 实验设计：我们选取了两个基因型（一个含有OPAQUE2基因，一个不含该基因）的玉米品种，在不同的发育阶段进行采样，提取总蛋白质，并进行二维凝胶电泳分析。

2. 实验结果：在两个基因型中，我们发现了一些差异表达的蛋白质斑点。

通过质谱分析，我们已经鉴定了一些斑点对应的蛋白质，包括某些酶类和调控蛋白。

3. 数据分析：我们使用了SPSS软件对二维凝胶图像进行了数字化和分析，得到了差异表达蛋白质的一些基本特征，如分子量，等电点值和差异表达倍数等。

4. 进一步工作：我们将进行更深入的数据分析，包括对差异表达蛋白质的功能进行细致的研究以及对差异表达的基因进行定位和分析，以便进一步探究opaque2玉米近等基因系蛋白差异表达的机制和意义。

总之，我们的中期报告显示，我们已经取得了一些有意义的结果，但仍需进行更深入的研究。

我们相信，通过我们的努力，我们将不断揭示opaque2玉米近等基因系蛋白差异表达的奥秘，为玉米品种改良和农业生产提供有力的支持。

基因差异表达分析方法及其在作物遗传育种中的应用苏在兴高闰飞李强【摘要】植物基因的差异表达是细胞形态和功能多样性的根本原因,也是各种生理及病变过程的物质基础.分析基因差异表达是近30年来分子生物学研究的重点,研究方法也从最早的差减杂交、差异显示PCR和cDNA代表性差异分析等,不断地发展到基于测序的表达系列标签和转录组测序技术,其中高通量测序技术的应用,使得分子生物学进入后基因组时代,特别是转录组测序可高效率、大批量地获取差异表达基因.通过基因差异表达分析,可挖掘农作物的优异农艺性状、高品质、抗性以及杂种优势等相关基因,辅助常规育种,提高农作物的品质、产量、抗性等综合性状,并为探究其机理、机制奠定基础.【期刊名称】《江苏师范大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2017(035)001【总页数】8页(P38-45)【关键词】基因差异表达;转录组测序;农艺性状;品质性状;抗性;杂种优势【作者】苏在兴高闰飞李强【作者单位】[1]江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室,江苏徐州221131;[2]中国农业科学院甘薯研究所,江苏徐州221131;[3]江苏师范大学生命科学学院,江苏徐州221116【正文语种】中文【中图分类】Q786植物基因差异表达是在转录水平上对基因的表达情况进行研究,包括2个及2个以上材料之间存在差异基因或者差异基因在相同环境条件下具有不同的表达模式,以及同一材料在不同处理下,同一基因呈现不同的表达模式2种情况．在真核生物基因组中,仅约10%～15%的基因在细胞中表达,而且在不同发育阶段、不同生理状态和不同类型的细胞中基因表达也不同[1]．基因的差异性表达是细胞形态及功能多样性的根本原因,也是植物生长发育和各种生理及病变的物质基础[2]．通过基因差异表达,分离新的功能基因、挖掘和鉴定差异表达基因的新功能等,对作物遗传改良具有十分重要的意义．目前,分子生物学技术逐步应用到作物遗传育种中,分子标记辅助育种、转基因育种以及分子设计育种正在成为作物遗传改良的重要手段[3]．1990年代开始,基因差异表达分析方法逐渐得到发展[4-12],并在挖掘新的功能基因以及揭示基因的新功能方面表现出优势．随着研究的深入,对差异性表达基因的富集程度要求更高,从而促使基因差异表达的筛选方法不断得以丰富和改进,尤其是测序技术的发展,使得差异表达基因的获得更加便捷,数量更多,效率更高[13]．本实验室也采用基因差异表达分析技术,解析徐薯18和徐781 2个甘薯品种在新陈代谢、抗逆性和碳水化合物积累等方面的机理机制,已获得一批与新陈代谢、抗逆性、物质积累等相关的功能基因．本文简要综述不同基因差异表达分析方法的特点、原理及优缺点,进一步阐述基因差异表达分析技术在作物农艺性状分析、品质性状分析、抗性分析以及杂种优势分析等方面的应用,以期对后续的研究工作有所裨益．1.1 基因差异表达分析方法1.1.1 差减杂交(subtractive hybridization,SH) 最初由Lamar等[4]于1984年报道,用于分离老鼠Y染色体的特异性探针．该方法也叫扣除杂交或减法杂交．差减杂交是对2种遗传背景大致相同而性状有差异的材料进行研究,基因组DNA或者mRNA(反转录成cDNA)经特定的核酸限制性内切酶消化后,在一定的条件下进行分子杂交,选择性地去除2部分共有基因杂交后形成的复合物,将含有目的基因的未杂交部分收集后装入载体,从而构建差减文库．佘卫炜等[14]用该方法成功地分离到6条与藏红花苷合成相关的特异性表达cDNA片段．该方法克服了示差筛选技术的局限性,灵敏度较高,也能有效检测转录丰度低的基因[15]，但操作难度大,费时费力,重复性较差,并且在酶切不彻底等情况下很难得到满意的结果[16]．1.1.2 mRNA差异显示逆转录PCR(differential display of reverse transcriptional PCR，DDRT-PCR) 1992年，Liang等[5]根据高等生物成熟的mRNA具有poly(A)尾巴的特性,建立了mRNA差异显示逆转录PCR．该方法利用含Oligo(dT)n的寡聚核苷酸作为锚定引物,通过逆转录酶的催化,将真核生物细胞中全部表达的mRNA逆转录为cDNA,通过PCR扩增,利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将有差异的片段分开,从而筛选出差异表达基因．张弛等[17]利用该方法研究水稻77-170(Oryza Sativa var. Japoinca)及其耐盐突变体M-20在盐胁迫下基因表达的差异,克隆到13个与盐诱导相关的cDNA片段,其长度范围在200～600 bp 之间．该方法具有技术应用成熟、效率高、灵敏度高的优点,实验每一步均可检测,无需实验结束，但假阳性率高,最高达70%,所得的cDNA片段较短,很难扩增到ORF(open reading frame)内部[18-19]．1.1.3 cDNA代表性差异分析(cDNA-RDA) 在Lisitsyn等[20]建立的DNA代表性差异分析(representational difference analysis,RDA)方法的基础上,1994年,Hubank等[6]建立了cDNA代表性差异分析技术．该技术对2组材料的cDNA 进行酶切消化,并为酶切片段连接特异寡聚核苷酸接头，进行PCR扩增,分别获得实验组(T)和对照组(D)的扩增子．再次酶切2组扩增子并对T组扩增子添加新接头,然后将T组扩增子与富余的D组扩增子混合,形成杂交体,用与新接头互补的特异引物对杂交体进行PCR扩增,其中T/T杂交体进行指数扩增,T/D杂交体进行线性扩增,D/D杂交体不扩增．对差异产物进行多轮PCR后,可用普通琼脂糖凝胶检测差异表达条带[21-22]．Ling等[23]将该技术运用于分离大豆不同萌发期子叶中的差异表达基因,并成功克隆到CysP1和CysP2 2个编码半胱氨酸蛋白酶的新基因．1.1.4 表达系列标签(serial analysis of gene expression,SAGE) 1995年,Velculescua等[7]首先提出基因表达系列分析技术,该方法通过限制性酶切含有生物素标记的cDNA,产生能够代表其相应转录物的cDNA短标签(9～14 bp),然后随机连接并进行测序分析．单一转录体由其特异性的短标签所代替,用SAGE软件定量分析标签的丰度,代表转录体的表达水平．Song等[24]采用SAGE法分析超级杂交稻LYP9及其亲本93-11、PA64s在不同时期、不同组织部位的差异表达基因,获得12种主要的基因表达模式,其中406个基因上调表达,469个基因下调表达,这些基因可能与水稻的杂种优势有关．该方法可以将多个短标签串联测序,能够寻找低丰度的转录物,但其依赖已测序的基因序列,过短的序列标签所涵盖的信息无法被准确注释到基因组上[25-26]．1.1.5 抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH) 1996年，Diatchenko等[8]提出抑制差减杂交,也叫抑制性消减杂交,结合了抑制PCR和差减杂交技术,利用抑制性PCR，选择性地扩增目的cDNA片段,显著增加了低丰度差异表达cDNA获得的概率．Tirumalaraju等[27]应用SSH技术从抗花生根结线虫和感花生根结线虫2份材料中获得70个差异表达ESTs,并证实各种非生物、生物(含根结线虫)胁迫和植物应答此类胁迫时与水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)及乙烯信号传导之间的关系．这些差异表达候选基因为获得抗根结线虫种质资源并培育优良抗性花生新品种提供可能．该方法简单、成熟、易操作,且效率高,筛选周期短,通常3～4 d可获得基因差异表达片段．但是SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA,不是全长cDNA;材料之间最好是存在细微差异,小片段缺失时也不能有效检测;实验中酶切后的cDNA与接头连接的效率是该方法的关键,若连接效率低,有些差异表达的基因就会漏检[18]．1.1.6 cDNA限制性片段长度多态性分析(cDNA-AFLP) 在Botstein等[28]建立的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法的基础上,1995年,Vos等[29]结合PCR扩增提出一种新的DNA指纹技术,即扩增片段长度多态性(amplification fragment length polymorphism,AFLP)．1996年,Bachem等[9]结合RT-PCR和AFLP提出cDNA-AFLP技术,用于对转录组表达情况进行分析．该技术采用2种不同的内切酶切割cDNA片段,并添加含有与引物序列互补的人工接头,进行PCR预扩增后用聚丙烯酰胺凝胶区分差异条带．Nie等[30]运用cDNA-AFLP技术从玉米亲本和杂交种的叶、根和成熟胚中分别分离到180、170和108个差异表达基因,为揭示玉米杂种优势提供了线索．cDNA-AFLP 技术具有很好的重复性,假阳性比较低,不需要预先知道基因的序列信息,能够通过扩增条带显色强度判断基因表达量的差异[31]．1.1.7 基因芯片(DNA Chips)技术是指把大量核酸片段固定在载体上,组成密集的按序排列的探针群,通过与标记样品的核酸杂交,判断靶核苷酸的有无或数量多少的一项技术,主要包括芯片的制备、杂交与检测等3个步骤．常见的芯片可分为2大类：一种是原位合成,适用于寡核苷酸;另一种是直接点样,多用于大片段DNA．姜兆远等[32]将Affymetrix表达谱芯片运用于水稻与稻瘟病不同小种的互作研究,水稻与稻瘟病菌非亲和互作的基因表达谱及其亲和互作的基因表达谱之间存在较大差异,将基因芯片筛选到的差异表达基因通过GO注释,明确了差异基因的分子功能及信号通路,有利于进一步了解植物抗病机制,并可能为稻瘟病防治提供新的途径．该方法同时将大量的探针固定于支持物上,可以同时对大量序列进行检测,克服了传统的核酸印迹杂交操作复杂、自动化程度低，且检测序列数量少等缺点．但该方法所用仪器及软件价格较昂贵,探针的合成和固定比较复杂,难以检测低丰度表达的基因[33]．1.1.8 半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR 半定量逆转录多聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)是探究基因差异表达的有效手段之一[10]．采用PCR技术同时对2组或多组材料的目的基因和内参基因(internal reference genes)进行扩增,运用琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物，并调节内参基因条带强度一致,便可直观地呈现出目的基因在不同组织或者不同材料中是否表达，且能对比其表达丰度[11，34]．1993年,Higuchi等[35]根据PCR延伸阶段随着DNA双链的生成,含有荧光的EB(ethidium bromide)染料能嵌入DNA链内部而激发荧光,提出实时荧光定量PCR(real time quantitative RT-PCR，qRT-PCR)的概念．荧光定量PCR具有很好的特异性,重复性好,操作简单快捷,全反应过程在一个封闭的PCR管中进行,可以实时地进行监测,而且扩增结束后不需要进一步处理．Applied Biosystems、Bio-RAd等公司推出实时荧光定量PCR配套的仪器和试剂,使得该技术在研究基因表达方面逐渐成为主流手段[36]． Fu等[37]采用SSH法从3份水稻材料中获得一批抗旱相关的基因,并用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR对300多条特异条带进行确证,为完善水稻抗旱相关QTLs及获得候选功能基因奠定基础．1.1.9 转录组测序(RNA-Seq)技术转录组(transcriptome),广义上指特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和,主要包括信使RNA(message RNA，mRNA)、核糖体RNA(ribosome RNA，rRNA)、转运RNA(transport RNA，tRNA)和非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)．狭义上,一般指特定组织或细胞中转录的全部mRNA[25]．转录组测序就是利用高通量技术对转录组进行测序分析,并对获得的读段进行过滤、组装以及生物信息学分析．RNA-Seq需要将mRNA反转录成cDNA,并对合成的cDNA作末端修复、加poly(A)尾巴及连接测序接头,片段化为测序平台所需的长度,PCR扩增,构建测序文库,利用相应的测序平台进行序列测定．对于有参考基因组序列的物种,可根据其参考序列(reference assembly)组装,没有参考基因组序列的物种,则进行从头组装(denovo assembly)[12,38]．根据组装情况,以单位长度的转录物上覆盖的读段数来衡量基因的表达水平(reads per kilo bases per million reads,RPKM)．RNA-Seq 主要用于研究2个及以上样本中基因的差异表达情况,如正常条件下的棉花幼苗和盐胁迫下的棉花幼苗等[39]．转录组测序技术具有较高的灵敏度,可以同时获得组织内的全部转录本;能检测出SNP等单个核苷酸的差异,具有很高的精确度;通过组装分析能得出基因家族中的不同拷贝或可变剪接．随着测序仪器的升级,RNA-Seq 费用逐渐下降，除了从测序数据中挖掘差异表达基因外,还可以挖掘SSR、SNP信息以及组装出尽可能完整的Unigenes序列,为后续的基因克隆和功能验证奠定坚实基础[40-45]．1.1.10 基因编辑技术近年来,锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、类转录激活样效应核酸酶(artificial transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和CRISPR-Cas9等[46]基因编辑技术(gene editing)逐步发展并得到广泛应用．基因编辑技术能在基因组水平上对DNA序列进行剪辑或插入,从而导致目的基因的表达受到抑制或表达产物失去相应的功能．Piffanelli等[47]发现,在与小麦亲缘关系较近的大麦中,MLO基因功能的缺失突变使其对白粉病产生广谱和持久的抗性．Wang等[48]采用TALEN和CRISPR-Cas9技术对小麦MLO基因进行编辑,已经获得具有广谱抗白粉病的小麦材料．Qi等[49]结合qRT-PCR检测NgAgo酶与不同引导序列组合作用下目标基因fabp11a的差异表达情况,表明NgAgo技术在降低基因表达水平方面表现出优异的特性．1.2 基因差异表达方法的特点比较SH、DDRT-PCR、cDNA-RDA等方法都是研究基因差异表达的有效工具(表1),其中SAGE、cDNA-AFLP等5种技术能检测出差异表达基因的表达丰度,而其他4种方法则不能;除SH外,其他基因差异表达分析方法均基于PCR技术．应用DDRT-PCR时,结合PCR扩增,可检测出低丰度的mRNA样品,而cDNA-RDA、SSH和cDNA-AFLP等需要经过2～3次PCR扩增,高度富集差异表达基因,保证有较高的特异性,减少假阳性率;SH、cDNA-RDA和SSH技术需要在2个材料之间进行杂交,故仅能检测2组mRNA的差异表达,其他方法可以同时比较多组材料;SAGE 和RNA-seq需要结合测序以及相应软件分析,才能获取差异表达片段以及各自的表达量,其他技术则通过扩增或杂交即可;DNA Chips和RT-PCR/qRT-PCR分别在设计杂交探针和扩增引物时需要预先知道基因序列信息,其他方法均不需要[8,11,28]．2.1 挖掘重要农艺性状相关基因农艺性状是指农作物的株高、生育期、育性及产量等可以代表作物特点的重要因子,是作物育种重要考察指标．Firon等[41]通过分析甘薯起始膨大根(initiating storage roots，ISRs)和纤维根(fibrous roots，FRs)的转录组信息,发现至少2.5倍的表达差异短片段8 353个,采用qRT-PCR法对其中Sporamin、AGPase和GBSS1等9个基因进行检测,表明这些差异表达基因参与碳水化合物的代谢和淀粉合成,促使储藏根的形成．Tao等[43]利用Illumina paired-end(PE)转录组测序技术,结合重头组装策略对甘薯7个不同组织的转录组进行分析,为甘薯组织特异表达基因和非生物逆境基因的研究奠定基础．程立宝等[50]对莲藕进行转录组测序分析,发现86个可能与莲藕根茎膨大相关基因,得到10 个贮藏蛋白合成和5 个淀粉合成相关基因,其中Lrplp8和Lrgbss对莲藕根状茎的膨大起到重要作用．育性是有性繁殖作物重要的农艺性状．雄性不育性的发现及三系配套育种、光温不育等概念的提出及成功运用,为新品种的培育和推广带来了极大的方便[51]．黄鹂等[52]利用拟南芥ATH1基因芯片与3种不同类型的白菜不育系及其共同保持系的花蕾的mRNA进行杂交,发现各不育系与保持系的花蕾中基因表达存在巨大差异,不同类型不育系之间花蕾转录组的组成特征也有差异．由于3种不育系与保持系花蕾的差异仅表现在花粉的形成和绒毡层的发育上,而其他花器官均无差别,从而推断这些差异表达的基因可能与花粉花药的发育有关．刘冬梅等[53]用陆地棉洞A 的不育株和可育株小孢子单核早期花药进行转录组测序,获得51个激素相关差异表达基因,首次分析小孢子时期激素相关基因在转录组水平上的差异,并对其中2个关键基因进行验证,为深入研究陆地棉洞A的不育机理和挖掘关键基因奠定了基础．2.2 挖掘重要品质性状相关基因随着农作物新品种的更迭以及栽培技术的革新,我国的粮食产量已达到比较理想的水平,人均收入逐步提高的同时,人们的食物消费开始转向有营养、益健康且口感佳的方向,所以对农产品的外观品质和营养品质等要求更高．外观品质是农产品商品价值的重要指标,如水稻种子灌浆不充分、胚乳中的淀粉粒等营养物质排列疏松导致垩白,影响稻米的外观品质[54]．Chen等[55]采用RNA-Seq法,在垩白率及胚乳垩白度均低的籼稻品种PYZX和垩白率及胚乳垩白度均高的粳稻品种P02428中发现5 552个差异表达基因,与PYZX相比,P02428中表达量较高的基因有3 603个,较低的基因1 949个;而与2亲本的高垩白重组自交系(recombinant inbred lines,RIL)混样相比,低垩白RIL混样中有88个基因表达量较高,623个基因表达量较低,从中分析确定33个可能与垩白相关的候选差异表达基因,为后续的基因功能验证和育种应用奠定了基础．营养品质包括淀粉及可溶糖等碳水化合物、蛋白质、脂肪酸等,不同加工用途对营养成分的要求不尽相同[56]．小麦、甘薯等是重要的淀粉类作物,利用基因差异表达技术分析淀粉合成相关的基因,对育种研究至关重要．小麦材料CB037A具有A 型(直径>10 μm)、B型(直径5～10 μm)和C型(直径<5 μm)3种淀粉粒,而PI330483仅有A型淀粉粒,Cao等[57]采用qRT-PCR法对这2份小麦材料的淀粉粒大小与AGPase大亚基、AGPase小亚基、SSⅠ、SSⅡa和SBEⅠ等淀粉合成相关基因的表达模式进行研究,发现SBEⅡa、SBEⅡb、WaxyD1和AGPase大亚基基因在2份材料中呈截然不同的表达模式．2.3 挖掘耐逆相关基因全球气候逐渐恶化,极端天气逐渐增多,其中干旱是非常普遍的现象,正考验着农业生产．Li等[58]利用基因芯片对玉米抗旱相关小RNA的基因差异表达进行分析,得到miR156、miR159、miR319等3个与抗旱相关的家族基因．Deng等[59]用差异表达的方法从耐旱玉米品系中分离到4个差异表达cDNA片段,并用实时荧光定量PCR分析这4个基因在干旱胁迫下的6个玉米近交系中的表达模式,证实候选基因在耐旱品系中呈上调表达,而在干旱敏感品系则相反．现代农业的投入逐渐加大,而农药、除草剂、化肥以及工业废弃物等各种形式的土地污染严重影响我国的粮食和其他经济作物的产出,植物功能基因的差异表达使其能最大限度地耐受逆境胁迫．Gao等[60]通过转录组测序技术获得紫花地丁镉处理与非镉处理条件下892个差异表达基因,且随机选取15个DEGs进行qRT-PCR 结果验证,为进一步研究其耐镉胁迫机制提供遗传学基础．印莉萍等[61]比较正常供铁和缺铁胁迫下铁高效型小麦(京-411)和铁低效型小麦(三属麦-3)的基因表达差异模式,获得ATP结合转运体(ATP binding cassette,ABC)的cDNA片段并进行Northern杂交,证明它的基因表达受缺铁胁迫的抑制．Kato等[62]利用基因芯片分析硝酸铵诱导下拟南芥和水稻中eIF6(eukaryotic translation initiation factor 6)基因的差异表达,发现该基因在这2种植物中呈现出不同的表达模式,表明eIF6基因在不同的物种中具有表达特异性．除了非生物胁迫外,病虫害等生物胁迫也给农业生产造成巨大的损失,所以挖掘生物胁迫应答基因，辅助选育抗病虫新品种,能有效地缓减农药的使用,增加农民收入和提高生产效率．Evers等[63]以抗马铃薯晚疫病品系Solanum phureja和感晚疫病双单倍体S. tuberosum subsp. tuberosum为材料,用差异显示mRNA法,获得与抗病性、胁迫应答、初级新陈代谢和次级新陈代谢相关的基因．2.4 挖掘与作物杂种优势相关的基因作物杂种优势是杂种后代在表型上优于亲本的现象,涉及作物病虫抗性、高产、高油以及高蛋白等多个方面．杂种优势在自然界比较普遍,但对其具体机理却知之甚少．近年来研究者试图运用基因差异表达技术揭示杂种优势的成因,并取得一定的进展．Zhao等[64]用棉花杂交种及其亲本进行杂种优势研究,发现其中差异表达基因有定量和定性的区别,定性差异是在亲本中高表达或低表达的基因在杂交种中显著高表达;而定量差异有4种基本模式,即在双亲中表达,但后代不表达(BPnF1);其中一个亲本表达,后代不表达(UPnF1);亲本均不表达,后代表达(UF1nP);双亲之一有表达,同时后代也表达(UPF1)．在亲本及其后代整个生长期叶片中观察到的基因差异表达可能是杂种优势现象的成因．Wang等[65]通过分析12个玉米近交系及其配组的33个杂交系的基因差异表达情况,发现基因在双亲及其杂种后代中均表达的模式占大多数,故杂种优势不仅与基因表达与否有关,还与基因的表达丰度有关;在玉米雌幼穗发育初期,杂交种的基因表达与双亲的基因表达差异最大;另外,某些基因在杂种中不表达，可以促进籽粒的发育并抑制幼穗中小花发育．利用基因差异表达分析技术,能挖掘新的功能基因，揭示基因的新功能等,为探究农作物的农艺性状、品质性状以及抗逆性等方面的机理机制奠定基础．随着生命科学进入后基因组时代,通过测序及功能注释将对DNA序列、基因表达通路、蛋白质结构及其互作关系等进行初步的鉴定．高通量测序技术和生物信息学的运用,结合qRT-PCR验证提高研究的准确性,也加快了该领域的研究进程．本课题组采用转录组测序技术,对比分析甘薯徐薯18和徐781的转录组信息,在一定程度上解释2种材料的淀粉含量差异和抗性差异(数据未发表),但其具体的调控机制有待进一步研究．未来,从基因差异表达分析入手获得相关功能的候选基因,采用基因编辑技术对目标基因进行敲除或降低其表达量,可逐步实现分子设计育种的目标[66-67]．*通讯作者:李强,男,研究员,博士,主要从事甘薯遗传与分子育种研究,E-mail:****************．【相关文献】[1] 吴乃虎.基因工程原理[M].2版.北京:科学出版社,1998.[2] 刘凯,曾继吾,夏瑞,等.mRNA差异显示技术及其在园艺植物上的应用(综述)[J].亚热带植物科学,2009,38(1):78.[3] 黎裕,王建康,邱丽娟,等.中国作物分子育种现状与发展前景[J].作物学报,2010,36(9):1425.[4] Lamar E E,Palmer E.Y-encoded,species-specific DNA in mice:evidence that the Y chromosome exists in two polymorphic forms in inbred strains[J].Cell,1984,37(1):171. 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《棉纤维发育相关基因的挖掘及优质转基因棉花的培育》篇一一、引言棉花作为全球重要的天然纤维来源，其纤维发育过程涉及到众多基因的调控。

近年来，随着分子生物学和基因工程技术的飞速发展，挖掘与棉纤维发育相关的基因并应用于优质转基因棉花的培育已成为棉花育种领域的研究热点。

本文旨在探讨棉纤维发育相关基因的挖掘方法及优质转基因棉花的培育技术。

二、棉纤维发育相关基因的挖掘1. 基因组学研究通过对棉花基因组进行深度测序和注释，可以鉴定出大量与纤维发育相关的候选基因。

这些基因在纤维发育的不同阶段发挥重要作用，包括纤维细胞的起始、伸长和次生壁形成等过程。

2. 转录组学研究转录组学研究可以揭示棉纤维在不同发育阶段的基因表达模式。

通过比较不同发育阶段或不同品种棉花的转录组数据，可以鉴定出与纤维品质、产量和抗逆性等性状相关的基因。

3. 分子标记辅助选择利用分子标记辅助选择技术，可以快速鉴定出与纤维品质性状紧密相关的基因。

这些标记可以用于棉花育种过程中的早期选择，提高育种效率。

三、优质转基因棉花的培育1. 转基因技术利用转基因技术，将与纤维发育、抗虫、抗病、抗逆等性状相关的基因导入棉花中，培育出具有优良性状的新品种。

转基因技术包括基因枪法、农杆菌介导法等。

2. 表达调控元件的发掘与应用表达调控元件对于基因的表达具有重要影响。

通过挖掘与棉花纤维发育相关的表达调控元件，并应用于转基因棉花的培育中，可以提高外源基因的表达水平，进而提高棉花的品质和产量。

3. 高效再生体系的建立建立高效、稳定的棉花再生体系是转基因棉花培育的关键步骤。

通过优化培养基成分、调整激素比例等方法，可以提高棉花的再生频率和同步性，为转基因棉花的培育提供有力保障。

四、实践应用与展望通过挖掘与棉纤维发育相关的基因并应用于优质转基因棉花的培育，可以有效提高棉花的品质和产量，同时增强其抗虫、抗病、抗逆等性状。

这不仅可以满足人们对高品质棉花的需求，还可以促进农业可持续发展。

三种植物线粒体基因低温差异表达比较分析作者：王赛赛李锦祝建波来源：《广西植物》2020年第08期摘要：線粒体作为植物细胞的能量代谢中心，在植物响应逆境胁迫中有重要的作用。

该研究基于雪莲（Saussurea involucrata）、番茄（Lycopersicon esculentum）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）三种不同低温耐受性植物的低温转录组。

通过blast比对和数据库检索筛选相关物种的线粒体基因，使用PlantCARE在线网站分析启动子，使用mega7软件对系统发育树构建分析。

结果表明：通过差异表达基因筛选，分别在雪莲、拟南芥、番茄中筛选出2、24、15个显著差异表达基因，主要包括线粒体核糖体亚基和电子传递链各复合体亚基，其中部分基因的低温差异表达情况如NAD1和NAD5，可能与植物的低温适应性有关;通过表达模式的聚类分析，雪莲与拟南芥在基因的表达模式上相对于番茄更为相近，且不同类别的基因表达模式在不同物种间差异较大;雪莲与其他菊科植物的呼吸链相关基因的蛋白序列具有很大差异，与万年藓（Climacium dendroides）、牛舌藓（Anomodon minor）等高山植物的进化距离较近。

在整体上拟南芥、番茄和雪莲三种植物线粒体基因在低温响应上具有很大差异，表明线粒体基因及其表达调控与植物的低温耐受性之间存在一定的关联性。

关键词：低温耐受性，植物，线粒体基因，表达模式中图分类号：Q943文献标识码：A文章编号：1000-3142（2020）08-1140-11Abstract：As the energy metabolism center of plant cells， mitochondria play an important role in plant response to stress. To analyze difference in expression mode of mitochdria gene from the Arabidopsis thaliana， Lycopersicon esculentum and Saussurea involucrata， the differential expression genes （DEGs） was filtered in the three low temperature transcriptomes and comparison analysis was performed on the DEGs from three plants. All the mitochondria genes were filtered through blast against the mitochondria genomes that was downloaded from the NCBI database. Promoter analysis was performed through PlantCARE online website and the mega software was used to phylogenetic tree construction. The results were as follows：In total， there were 2， 24 and 15 DEGs were found in Saussurea involucrata， Arabidopsis thaliana and Lycopersicon esculentum，and these genes were mainly focused on mitochondrial ribosomal and electron transfer chain complex subunits; A few genes were seemed to relate to the cold adaptation that the expression level was positive to the ability of cold tolerance of the three plants， especially for the NAD1 and NAD5 gene; Through cluster analysis of expression patterns， Saussurea involucrata and Arabidopsis thaliana were more similar in genes expression mode than Lycopersicon esculentum， and the expression mode of different genes had a quite difference between different plants; Further analysis on the conserved motif sequence of these genes， the sequences of Saussurea involucrata showed more close relationship with the alpine plants such as Climacium dendroides and Anomodon minor than the other compositae plants. In general， the mitochondrial genes had a quite difference on the sequence of conserved motif and expression mode under the cold condition between the Arabidopsis thaliana，Lycopersicon esculentum and Saussurea involucrata. It was concluded that the mitochondria genes and its expressional regulation could be implicated in the cold adaptation of plants.Key words：low temperature tolerance， plants， mitochondrial gene， expression mode植物线粒体通过氧化磷酸化提供生命活动所需的各种能量，在光呼吸代谢、C4植物的光合作用和景天酸代谢（Picault et al.， 2004）等途径中发挥着重要作用。